太平洋牡蠣中Cg-IL-17和Cg-TGF-β的表達及其免疫作用的研究

董洪亮，劉乃國*，倪娜，李彩玉，鄭靜，苗雙

（1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)實驗室，山東濱州256600）

太平洋牡蠣中Cg-IL-17和Cg-TGF-β的表達及其免疫作用的研究

董洪亮1，劉乃國1*，倪娜1，李彩玉1，鄭靜1，苗雙1

（1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)實驗室，山東濱州256600）

目的：探討Cg-IL-17和Cg-T G E-β在太平洋牡蠣中表達的組織定位、免疫作用及其可能的機制。方法：采用Real-time PC R、原位雜交和圖像分析的方法進行研究。結(jié)果：實時定量P C R研究表明，Cg-IL-17和Cg-T G E-β在弧菌感染后的太平洋牡蠣的鰓、外套膜、心包液、唇須、消化道和閉殼肌中表達明顯增強。原位雜交實驗結(jié)果表明，Cg-IL-17和Cg-T G E-β在未染菌組牡蠣的消化道、消化腺、鰓、唇須、外套膜中都有表達；染菌組以上各組織中的Cg-IL-17和Cg-T G E-β表達量均有顯著增高，而消化道、消化腺中的表達量明顯高于其他組織，閉殼肌中也均有微弱表達；感染弧菌前后兩種基因在性腺中均未見表達。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)這兩種基因表達量在唇須和外套膜中具有明顯的相關(guān)性。結(jié)論：Cg-IL-17和Cg-T G E-β具有多種生物學(xué)效應(yīng)，且都參與了太平洋牡蠣的固有免疫反應(yīng)；消化道可能是牡蠣主要的免疫反應(yīng)器官之一；Cg-IL-17和Cg-T G E-β在唇須和外套膜中可能存在調(diào)控關(guān)系或協(xié)同作用。

太平洋牡蠣；牡蠣IL-17；牡蠣T G E-β；組織定位；免疫反應(yīng)

董洪亮，劉乃國，倪娜，等.太平洋牡蠣中Cg-IL-17和Cg-T GE-β的表達及其免疫作用的研究［J］.海洋學(xué)報，2015，37（2）：104—110，doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2015.02.011

Dong H ongl iang，Liu Naiguo，Ni Na，et al.Study on the expression and im mune function of Cg-IL-17 and Cg-T GE-βin the Pacific oyster，Crassostrea gigas［J］.Haiyang Xuebao，2015，37（2）：104—110，doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2015.02.011

1　引言

在無脊椎動物的免疫系統(tǒng)中，對病原體的防御機制是固有免疫，涉及細胞防御和體液反應(yīng)兩個方面［1—3］。細胞防御，是指通過細胞吞噬作用，或在血淋巴中釋放酶來進行防御［4—5］。體液反應(yīng)，則是通過合成抗細菌肽或抗真菌肽來進行抵御［6］。這些肽主要有兩類：防御肽和調(diào)節(jié)性細胞因子。IL-17和T GE-β可能就是其中的兩種重要的調(diào)節(jié)性細胞因子［7—8］。

牡蠣有豐富的營養(yǎng)價值和藥用價值，牡蠣中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在IL-17（Cg-IL-17）和T G E-β（Cg-T G E-β）兩種基因，并發(fā)現(xiàn)細菌感染能夠引起太平洋牡蠣中Cg-IL-17和Cg-T G E-β的表達增高，說明這兩種基因可能都是牡蠣對抗病原體的早期反應(yīng)基因［7，9］。但Cg-IL-17和Cg-T G E-β在哪些組織細胞中表達目前仍不清楚，因此研究太平洋牡蠣中Cg-IL-17和Cg-T G E-β基因表達的定位分布對了解太平洋牡蠣免疫反應(yīng)機制及其免疫系統(tǒng)的進化都具有重要意義。本研究首次應(yīng)用原位雜交技術(shù)研究Cg-IL-17和Cg-T G E-β表達的組織定位，并用Real-time PC R方法進行相互驗證，探討它們在太平洋牡蠣免疫反應(yīng)中的作用及其可能機制。

2　材料與方法

2.1材料、試劑與引物

新鮮太平洋牡蠣購于水產(chǎn)市場，燦爛弧菌和漫弧菌購于中國海洋大學(xué)生命學(xué)院微生物實驗室，M axima Eirst Strand cD N A Synthesis Kit for R T-qPC R，Maxima SY BR Green/Eluorescein qPCRM aster Mix（2×）購自Thermo公司，M yLabRPC R法DIG標記試劑盒購自北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司。

應(yīng)用Primer（version 5.0）軟件，根據(jù)太平洋牡蠣細胞因子IL-17及T G E-β的基因序列，分析設(shè)計特異性引物。據(jù)太平洋牡蠣Actin基因序列，設(shè)計內(nèi)參基因Actin的引物。引物有上海生工技術(shù)有限公司合成。引物序列見表1。

表1　本研究中所用引物序列Tab.1 The primer sequence for PCR amplification in this study

2.2太平洋牡蠣弧菌感染實驗

取燦爛弧菌和漫弧菌兩種新鮮菌液離心，去上清，滅菌的海水重懸菌體，分光光度計測O D550，配成1×108bacteria/100μL混合菌液，用于太平洋牡蠣染菌實驗。

購買生長3年大小相近的太平洋牡蠣32只，隨機分成兩組，每組16只。在15℃滅菌海水中飼養(yǎng)適應(yīng)24 h后進行實驗。采用閉殼肌注射的方法，實驗組每只注射1×108bacteria/100μL燦爛弧菌和漫弧菌混合菌液，對照組每只注射100μL滅菌的海水。12 h后，取各組組織進行后續(xù)實驗。

2.3Real-time PCR法檢測細胞因子Cg-IL-17、Cg-TGF-β的轉(zhuǎn)錄表達

2.3.1組織總R N A的提取及cD N A的合成

12 h后，從實驗組和對照組各隨機取8只，解剖剝離出外套膜、鰓、消化道、唇須、閉殼肌，研磨成粉狀，按每50～100 mg組織加1 m L Trizol。抽取每只太平洋牡蠣的心包液，放入無R N A酶的離心管中，離心去上清，獲得的細胞懸浮加入適量Trizol。按總R N A常規(guī)提取方法，提取各組織總R N A。用分光光度計測定R N A的濃度及純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測R N A完整性。用D NaseⅠ消化去除R N A中的D N A，用D Nase inactivation reagent終止反應(yīng)后，離心收集無D N A污染的R N A，加入適量的R N A酶抑制劑。用M axima Eirst Strand cD N A Synthesis Kit進行反轉(zhuǎn)錄。合成的cD N A保存于-80℃，備用。

2.3.2Real-time PC R定量檢測

以Actin作為內(nèi)參基因，用Real-time PC R法對實驗組和對照組各組織細胞因子Cg-IL-17和Cg-T G E-β的表達進行相對定量。反應(yīng)體系為25μL。擴增反應(yīng)條件：50℃2 min；95℃10 min；變性95℃15 s、退火55.8℃30 s、延伸72℃30 s，30個循環(huán)。所得數(shù)據(jù)用2-△△CT法進行統(tǒng)計分析。

2.4原位雜交法檢測細胞因子（IL-17、TGF-β）的表達水平

2.4.1探針的合成

用引物P-IL-17-E/P-IL-17-R、P-T G E-β-E/PT G E-β-R，根據(jù)“PC R法DIG標記試劑盒”合成IL-17探針及T G E-β探針，分光光度計測探針濃度，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2組織切片的制備

取實驗組及對照組各組織，于4%多聚甲醛內(nèi)固定48 h，常規(guī)脫水、透明、包埋、切片，切片厚度為4 μm，所用載玻片經(jīng)多聚甲醛處理。

2.4.3原位雜交檢測

對實驗組和對照組每一組織均選取兩張切片，一張用于探針雜交，另一張用于空白對照。經(jīng)二甲苯脫蠟，常規(guī)梯度酒精水化，D EPC水平衡。用0.2 mol/L的H Cl處理后，再用蛋白酶K（7.5μg/m L）進行消化，0.2%的甘氨酸終止反應(yīng)。而后經(jīng)4%多聚甲醛固定，0.1%PBS洗滌。42℃在濕盒中，探針雜交組加雜交液（探針50 nmol/L），探針空白組加預(yù)雜交液（不加探針），用原位雜交專用蓋玻片封片，42℃濕盒中雜交16～18 h。雜交后，依次用2×SSC/0.1%SDS、0.1 ×SSC/0.1%SDS進行洗滌。加入連接有堿性磷酸酶的抗地高辛抗體，常溫下孵育1～2 h。N BP/BCIP顯色液避光顯色2～6 h。最后經(jīng)0.1%核固紅復(fù)染2 min，酒精梯度脫水后，二甲苯透明，封片。顯微鏡下觀察、拍照，并用北京航空大學(xué)研制的M otic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，所得數(shù)據(jù)用SPSS軟件進行分析。

3　結(jié)果

3.1實時定量PCR實驗結(jié)果

細胞因子Cg-IL-17 m R N A表達進行分析，結(jié)果顯示，實驗組鰓、外套膜、唇須、心包液中Cg-IL-17的轉(zhuǎn)錄水平增高，分別是對照組相應(yīng)組織的1.95倍（p＜0.05）、3.61倍（p＜0.05）、4.69倍（p＜0.05）和3.36倍（p＜0.05）；消化道、閉殼肌中Cg-IL-17的轉(zhuǎn)錄水平顯著增高分別是對照組的28.44、38.85倍（p＜0.01）（圖1）。

細胞因子Cg-T G E-βm R N A表達進行分析，結(jié)果顯示，實驗組鰓、外套膜、唇須、心包液中Cg-T GE-β的轉(zhuǎn)錄水平增高，分別是對照組相應(yīng)組織的3.73倍（p＜0.01）、3.68倍（p＜0.01）、2.06倍（p＜0.05）和3.41倍（p＜0.01）。消化道、閉殼肌中Cg-T G E-β的轉(zhuǎn)錄水平顯著增高分別是對照組的6.11、6.54倍（p＜0.01）（見圖2）。

圖1　real-time PC R實驗中Cg-IL-17的m R N A表達（*p＜0.05，**p＜0.01）Eig.1 The m R N A expression of Cg-IL-17 by real-time PC R（*p＜0.05，**p＜0.01）

3.2原位雜交實驗結(jié)果

細胞因子Cg-IL-17和Cg-T GE-β原位雜交實驗結(jié)果表明，實驗組和對照組的腸道、鰓、外套膜、唇須中均有陽性信號，且實驗組陽性信號強于對照組。閉殼肌在對照組中未見陽性信號，實驗組中有微弱的陽性信號。實驗組和對照組中性腺均未見陽性表達信號（見圖3A、圖4A）。空白對照組各組織均未見陽性信號。

對原位雜交實驗結(jié)果圖像進行分析，實驗組中細胞因子Cg-IL-17和Cg-T G E-β表達量均明顯高于對照組（p＜0.01）（見圖3B、圖4B），其中消化腺和腸道的表達量最高（p＜0.01）。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Cg-IL-17和Cg-T G E-β的表達量之間在唇須（r =0.772 602，p＜0.05）和外套膜（r=0.756 731，p＜0.05）中具有相關(guān)性，在其他組織中沒有明顯的相關(guān)性（p＞0.05）。

圖2　real-time PC R實驗中Cg-T GE-β的m R N A表達（*p＜0.05，**p＜0.01）Eig.2 The m R N A expression of Cg-T GE-βby real-time PC R（*p＜0.05，**p＜0.01）

4　討論

本實驗研究表明，太平洋牡蠣弧菌感染后Cg-IL-17和Cg-T G E-βm R N A在實驗組的鰓、外套膜、唇須、消化道、閉殼肌、心包液中的表達與對照組相應(yīng)組織相比明顯增高，其中以消化道和閉殼肌增高最為明顯。這與以往報道細菌感染后Cg-IL-17和Cg-T G E-β表達增高結(jié)果相似［7，9］。本研究原位雜交實驗表明，Cg-IL-17和Cg-T G E-βm R N A在實驗組消化道、消化腺、鰓、唇須、外套膜中的表達明顯高于其在對照組相應(yīng)組織中的表達，對照組閉殼肌未見陽性信號，而實驗組閉殼肌中也只有微弱表達，性腺組織在對照組和實驗組中均未見陽性信號。閉殼肌中這兩種基因的表達在原位雜交和實時定量PCR檢測中結(jié)果似乎不一致，這是因為實時定量PCR法擴增后比原位雜交方法敏感度要高，并且實時定量PC R方法只是相對定量，所用2-△△CT法反映的是實驗組和對照組基因表達的倍數(shù)關(guān)系，因此結(jié)果并不矛盾。

Lelong等報道，T G E-β在太平洋牡蠣中具有廣泛表達的模式，但在某種組織（唇須和鰓）表達量較高，說明它可能是具有多種效應(yīng)的細胞因子，包括細胞生長和分化的調(diào)節(jié)［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，細胞因子Cg-IL-17和Cg-T GE-β在牡蠣的多種組織中都表達，這也進一步說明兩種細胞因子可能都具有多種生物學(xué)效應(yīng)。染菌后實驗組中細胞因子Cg-IL-17和Cg-T GE-β表達明顯高于對照組相應(yīng)組織中的表達，進一步證明這兩種細胞因子均參與了牡蠣對抗病原體的固有免疫反應(yīng)。

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，細胞因子Cg-IL-17和Cg-T G E-β表達量之間在唇須和外套膜中具有明顯的相關(guān)性，而在其他組織中沒有明顯的相關(guān)性。說明在唇須和外套膜中Cg-IL-17及Cg-T G E-β這兩種細胞因子間存在某種聯(lián)系。W u等報道，珍珠貝中的PfIL-17基因與Cg IL-17基因結(jié)構(gòu)相似，PfIL-17可能涉及激活N E-кB信號通路對抗細胞外病原體的感染［10］。Lelong等研究發(fā)現(xiàn)，Cg-T G E-β啟動子結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)特異的保守基序，如Rel/N EкB基序，Cg-T G E-β及其特定的T G E-β通路，可以刺激一些體液細胞因子基因的表達［7］。Lemaitre等報道在缺乏適應(yīng)性免疫的無脊椎動物中，Toll和Imd通過N E-кB發(fā)揮作用的信號通路被認為是宿主防御的最重要的信號通路［11］。綜上所述，我們推測在病原體防御過程中，細胞因子Cg-IL-17和Cg-T G E-β可能通過N E-кB發(fā)揮作用的信號通路聯(lián)系在一起，它們之間可能存在調(diào)控關(guān)系或協(xié)同作用，這需要進一步研究驗證。

本研究兩種實驗方法均證明，染菌后牡蠣消化道中細胞因子Cg-IL-17和Cg-T G E-β表達增高最為明顯，而且原位雜交結(jié)果提示消化道中兩種基因的表達量也高于其他組織，說明消化道可能是牡蠣主要的免疫反應(yīng)器官之一，其他組織包括鰓、外套膜、唇須，也參與機體的免疫應(yīng)答。

圖3　原位雜交實驗中Cg-IL-17 m R N A的表達結(jié)果Eig.3 The results of Cg-IL-17 m R N A expression by in situ hybridization

圖4　原位雜交實驗中Cg-T GE-βm R N A的表達結(jié)果Eig.4 The results of Cg-T GE-βm R N A expression by in situ hybridization

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Study on the expression and im mune function of Cg-IL-17 and Cg-TGF-βin the Pacific oyster，Crassostrea gigas

Dong H ongl iang1，Liu Naiguo1，Ni Na1，Li Caiyu1，Zheng Jing1，Miao Shuang1
（1.Clinical Medicine Laboratory，Einzhou Medical University Affiliated H ospital，Einzhou256600，China）

Objective：to explore the tissue local ization，im mune function and the possible mechanism of Cg-IL-17 and Cg-T G E-βinCrassostrea gigas.Methods：using real-time PC R，in situhybridization and image analysis methods，the expressions of Cg-IL-17 and Cg-T GE-βwere studied.Results：the results ofreal-time PC R showed thatthe expressions of Cg-IL-17 and Cg-T GE-βwere up-regulated in the tissues ofC.gigas，including gi lls，mantle edge，labial palp，digestive tract，adductor muscle after being infected withVibrio，and so did in pericardiacl iquor.The results ofin situhybridization assay indicated that both Cg-IL-17 and Cg-T G E-βexpressed in tissues of uninfected group，including digestive tract，digestive glands，gi lls，labial palp and mantle edge.InVibrioinjected oysters，the expressions of Cg-IL-17 and Cg-T GE-βin above-mentioned tissues increased obviously compared with the same control tissues.The highest expressions of the two genes were found in digestive tract and digestive glands，and the weak expressions were appearedin adductor muscle.But no positive signal wasfound in gonad ofthe two groups.Correlation analysis impl ied that thereis significant correlation between Cg-IL-17 and Cg-T G E-βin labial palp and mantle edge.Conclusion：Cg-IL-17 and Cg-T G E-βpossess a variety of biological effects.Their expressions markedly increased inC.gigasafterVibrio-infection，suggesting that both cytokines take part in the innate im mune response.The digestive tract may be one oftheimportantim mune organs ofCrassostrea gigas，because the strongest signals of the two genes were found in the tissue.There is regulatory or synergistic action between Cg-IL-17 and Cg-T GE-βin labial palp and mantle edge probably.

Pacific oyster；Cg-IL-17；Cg-T GE-β；tissue local ization；im mune response

S917.4

A

0253-4193（2015）02-0104-07

2014-05-05；

2014-06-03。

山東省高等學(xué)校科技計劃項目：牡蠣藥用基因IL-17的體外表達和組織定位研究（J10LC81）。

董洪亮（1987—），男，山東省煙臺市人，主要從事細胞分子生物學(xué)研究。E-mai l：hongl iang.234@163.com

劉乃國，男，教授，主要從事細胞分子生物學(xué)研究。E-mai l：l iunaiguo1966@163.com