天津漢族群體DYS19、DYS390和DYS393 STR基因座遺傳多態性的研究

琚 端，史云芳，李曉洲，李 巖，辛 力，姚靜怡，謝曉媛，劉殿芹，楊曉惠，周佳妍，張 穎

（1.天津醫科大學總醫院婦產科，天津300052；2.天津市婦女兒童保健中心，天津300074；3.天津醫科大學影像學院，天津300203）

我國是出生缺陷高發國家，出生缺陷逐漸成為影響兒童健康和出生人口素質的重大公共衛生問題。染色體非整倍體異常是導致出生缺陷最常見的原因。盡管染色體核型分析是診斷染色體病的金標準，但因其培養時間長、技術要求高，不能滿足日益增長的產前診斷需要。短串聯重復序列（short tandem repeat,STR）又稱微衛星DNA，是一種廣泛存在于人類基因組中，以2～6個堿基為單位，具有長度多態性的DNA序列。Y-STR在減數分裂過程中不發生重組，具有穩定的單倍體父系遺傳特征，被廣泛用于個體識別、親權鑒定、群體遺傳學研究等領域。近年來，定量熒光PCR（QF-PCR）擴增STR基因座已在許多歐洲國家被應用于產前診斷染色體非整倍體的檢測[1-2]。STR基因座具有顯著的人種和地域分布差異，因此國際遺傳學DNA委員會倡導建立各地區各種族的群體遺傳學數據[3-4]。筆者對天津漢族男性群體Y染色體上DYS19、DYS390和DYS393 3個STR基因座的遺傳多態性進行了研究，為天津地區性染色體異常的基因診斷和產前診斷提供實驗依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集200例籍貫為天津、三代居住在天津且無親緣關系的漢族男性個體外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝，-20℃保存。所有樣本經染色體核型分析結果正常。

1.2 DNA的提取 采用全血基因組DNA提取試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），實驗步驟嚴格按照說明書進行。

1.3 引物選擇 根據NCBIUniSTS數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unists），確定基因座的引物序列，正向引物5’端均由熒光染料5-羧基熒光素標記，引物均由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成。DYS19、DYS390和DYS393基因座的基本特征及引物序列見表1。

1.4 QF-PCR擴增 以提取的基因組DNA為模板，在GeneAmp PCR system 9600擴增儀上進行PCR 反應。PCR 擴增體系：d NTPs 1μL，10×PCR buffer 2.5μL、模板 DNA 2μL、上游引物 0.5μL、下游引物0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O18 μL，總體積為25μL。擴增條件為預變性95℃5 min、變性 95℃30 s、退火 52℃30 s、延伸 72℃30 s，35個循環，最后72℃10min，4℃保存。

1.5 PCR擴增產物檢測 產物經毛細管電泳檢測，ABIPrism GeneMapper v3.0軟件分析數據，得出片段大小，整理結果。

1.6 測序及命名 3個基因座分別選擇兩個片段進行測序，根據重復序列的重復次數進行命名。測序由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司完成。

1.7 統計學方法 用直接計算法計算各等位基因頻率，基因多樣性（GD）采用公式 GD=n（1－ΣPi2）/（n－1）計算，其中Pi為等位基因頻率，n為樣本數。單倍型多樣性（HD）用公式HD＝n（1－ΣHPi2）/（n－1）計算。

2 結果

2.1 DYS19、DYS390和DYS393基因座測序結果DYS19基因座測序185 bp、201 bp兩個片段，重復序列為TAGA，分別重復7、11次，將其命名為7、11。DYS390基因座測序208 bp、224 bp兩個片段，重復序列為TCTA，分別重復9、13次，將其分別命名為9、13。DYS393 基因座測序 117 bp、121 bp 兩個片段，重復序列為TATC，分別重復12、13次，將其分別命名為12、13。

2.2 DYS19、DYS390和DYS393基因座基因頻率及單倍型頻率 200例漢族男性樣本均擴增成功，其中DYS19基因座共發現5個等位基因。等位基因頻率在0.070 0～0.377 5之間。DYS390基因座共發現6個等位基因。等位基因頻率在0.005 0～0.390 0之間。DYS393基因座共發現6個等位基因。等位基因頻率在0.005 0～0.540 0之間。3個基因座的GD值分別為0.743、0.731及0.634。在本文調查的200例天津男性中，3個基因座共發現63種單倍型，其中最多見的單倍型為 8-11-12（0.075），在 15 個個體中出現，單倍型多樣性為 0.706 8。DYS19、DYS390和DYS393基因座的基因頻率見表2。

表2 DYS19、DYS390和DYS393基因座基因頻率Tab2 Gene frequenciesof DYS19、DYS390 and DYS393

3 討論

《中國出生缺陷防治報告（2012）》指出，我國出生缺陷發生率為5.6%左右，每年新增出生缺陷兒約為90萬例。染色體非整倍體異常是導致出生缺陷最常見的原因。常見的異常包括21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征、克氏綜合征（47，XXY）、Turner綜合征 （45，X）、Jacobs綜合征（47，XXX）以及超雄綜合征（47，XYY），約占產前診斷臨床有意義染色體異常的80%[5]。目前診斷及產前診斷染色體病的金標準是染色體核型分析，但該方法對技術要求高、分析培養時間長，有培養失敗的可能，一旦培養失敗不但會造成孕婦及家屬較重的精神負擔并且會延誤最佳處理時機。

QF-PCR技術是一種利用熒光引物對染色體上特異性STR位點進行擴增，通過熒光檢測染色體拷貝數異常并做出快速產前診斷的方法。因具有準確、簡便、快速、自動化、高通量等優點，一些歐洲產前診斷中心已常規將13、18、21、X以及Y染色體的STR基因座用于染色體非整倍體的診斷和產前診斷[1-2]。Plaseski等[6]利用多重QF-PCR方法通過擴增X-STR基因座、SRY基因、Y-STR基因座DYS448和AZF相關基因等聯合檢測男性不育的遺傳性原因，包括染色體異常和Y染色體微小缺失等。

STR最早于真核生物基因組中被發現[7]，因其核心序列的重復次數存在個體差異，故多數STR基因座具有高度多態性。1976年Cooke[8]首先報道了存在于Y染色體上的STR，之后越來越多的Y染色體STR基因座被開發并利用。與常染色體STR基因座分型相比，Y染色體上的基因座無需進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，只需要單倍型分析即可，應用方便。聯合多個STR復合擴增可極大程度降低偶合概率，提高個體識別率。男性群體STR基因座的研究表明，Y-STR基因座多態性的分布具有明顯的種族、地域差異性。在不同人群甚至關系相近的人群中，其基因頻率分布均不同[9-10]。因此，建立當地的等位基因頻率和基因型分布資料是利用YSTR進行快速產前診斷的前提和數據基礎。

目前，人類基因組數據庫中可供人類遺傳學研究的Y染色體遺傳標記有200多個，其中DYS19、DYS385a/b、DYS389…、DYS389…、DYS390、DYS391、DYS392和DYS393是歐洲Y染色體分型學會建立的“最小單體型”中最常用的一組多態性位點[11]。本研究根據文獻報道及預實驗選擇了常用的易于擴增、結果穩定、重復性好、多態性較高的3個基因座DYS19、DYS390和DYS393進行研究。結果顯示DYS19、DYS390和DYS393 3個基因座分別發現5、6、6個等位基因，基因頻率分別在0.070 0～0.377 5、0.005 0～0.390 0、0.005 0～0.540 0 之間，3個基因座的基因多樣性分別為0.743、0.731、0.634。200例樣本中共檢出63種單倍型，單倍型多樣性為0.706 8。一般來說，STR多態信息量大于0.5，表明遺傳標記可提供高度的遺傳信息[12]。結果顯示，這3個基因座構成的單倍型多態性信息含量較高，具有較高的個體識別率，可提供高度的遺傳信息。目前試劑盒中基因座的選擇主要基于歐洲、非洲等人群中各個Y-STR的基因座個體識別能力的考慮[13]。然而研究表明不同群體、不同地域關于Y-STR基因座的遺傳學數據相比有一定的差異[14]。張玉紅等[15]對342例南通漢族無血緣關系男性個體的16個Y染色體STR基因座進行研究，DYS19、DYS390和DYS393 3個基因座分別發現6、6、6個等位基因，GD分別為0.904 2、0.642 6、0.635 7。宋興勃等[16]研究 111 名成都地區漢族群體17個Y-STR基因座多態性分布，3個基因座分別發現6、6、5個等位基因，GD分別為0.669 3、0.651 4、0.650 3。Brown[17]在研究中提到所有利用QF-PCR進行染色體非整倍體產前診斷的實驗室都該建立自己獨立有效的數據基礎。本研究通過對來本院進行優生咨詢的無親緣關系漢族男性3個Y-STR遺傳多態性的研究，建立了本地區、本實驗室的人群數據基礎和適合本地區人群的反應體系，為性染色體數目異常的基因診斷及產前基因診斷提供了實驗數據。

[1]Cirigliano V,Voglino G,Ordo觡ez E,etal.Rapid prenatal diagnosis of common chromosomeaneuploidiesby QF-PCR,resultsof 9 years of clinicalexperience[J].PrenatDiagn,2009,29(1):40

[2]Hills A,Donaghue C,Waters J,etal.QF-PCR asa stand-alone test for prenatal samples:the first2 years′experience in the London region[J].PrenatDiagn,2010,30(6):509

[3]Nasiri H,Noori-DalooiM R,Dastan J,etal.Investigation of QFPCR application for rapid prenatal diagnosis of chromosomal aneuploidies in iranian population[J].Iran JPediatr,2011,21(1):15

[4]Jain S,Panigrahi I,Sheth J,etal.STRmarkers for detecting heterogeneity in Indian population[J].MolBiolRep,2012,39(1):461

[5]Jain S,Panigrahi I,Sheth J,etal.STRmarkers for detecting heterogeneity in Indian population[J].MolBiolRep,2012,39(1):461

[6]PlaseskiT，NoveskiP，Trivodalieva S.Quantitative fluorescent-PCR detection of sex chromosome aneuploidiesand AZF deletions/duplications[J].GenetTest,2008,12(4):595

[7]Miesfeld R,KrystalM,Arnheim N.Amember of a new repeated sequence familywhich is conserved throughouteucaryotic evolution is found between the human delta and beta globin genes[J].Nucleic AcidsRes,1981,9(22):5931

[8]Cooke H.Repeated sequence s specific to humanmales[J].Nature,1976,262(5565):182

[9]White PS,Tatum O L,Deaven L L,etal.New,male-specificmicrosatellitemarkers from the human Y chromosome[J].Genomics,1999,57(3):433

[10]Xu AQ,Xia M,Liu JT.Validation of quantitative fluorescent-PCR for rapid prenatal diagnosisof common aneuploidies in the Chinese population[J].GenetMolRes,2013,12(4):6379

[11]Roewer L,Krawczak M,WilluweitS,etal.Online reference database ofEuropean Y-chromosomalshort tandem repeat(STR)haplotypes[J].Forensic Sci Int,2001,118(2/3):106

[12]ArmstrongRN,Colyer H A,Mills K I.Screening formiRNA expression changesusingquantitative PCR(Q-PCR)[J].MethodsMolBiol,2012,863(3):293

[13]Kayser M,Kittler R,Erler A,etal.A comprehensive survey of human Y-chromosomalmicrosatellites[J].Am JHum Genet,2004,74(6):1183

[14]葛建業，嚴江偉，謝群，等.中國Y-STR數據庫建設相關問題探討[J].法醫學雜志,2013,29(3):212

[15]張玉紅，賈東濤，韓海軍，等.南通漢族群體16個Y-STR基因座遺傳多態性[J].中國法醫學雜志,2008,23(3):197

[16]宋興勃，范紅，應斌武，等.成都地區漢族人群17個Y短串聯重復序列基因座遺傳多態性分析[J].南方醫科大學學報,2009,29(10):1973

[17]Brown L,AbiganiaM.Warburton D.Validation ofQF-PCR for prenatal aneuploidy screening in the United States[J].Prenat Diagn,2006,26(11):1068