全外顯子組測序發現FUT6基因在1例糖尿病腎病中的終止突變

王玉華，蔡春友，李衛東，韓鴻玲

（1.天津醫科大學基礎醫學研究中心，天津300070；2.天津醫科大學總醫院腎臟科，天津300052）

隨著人們生活水平的提高、飲食結構的改變和體力勞動的減少，糖尿病發病率與日俱增。根據國際糖尿病聯盟（IDF）統計，2011年全球糖尿病患者數為3.66億，預計2030年將達到5.52億。糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是以糖代謝異常為主要原因所致的腎小球硬化并伴尿蛋白含量異常，是糖尿病的嚴重微血管并發癥，亦是糖尿病患者的主要死亡原因之一，在我國糖尿病腎病已經成為導致終末期腎病的第二大原因，有資料表明每年新發的終末期腎病中DN占40%[1]。盡管以往研究認為糖尿病病程長和控制不良是DN的重要危險因素，但近來大量資料表明遺傳因素在DN的發生發展中起關鍵作用[2-3]，因此關于2型糖尿病腎病的遺傳學研究成為近年來研究的熱點。我們曾在1例無微量蛋白尿的早期DN患者的腎活檢組織中，發現有TGF-β1、TGF-βR1 和 Smad3 表達升高，目前該患者已發展為終末期腎病。為研究該患者DN早期TGF-β途徑激活的可能分子機制，進一步探尋與2型糖尿病腎病的相關致病基因，了解DN的遺傳背景，我們對這例DN患者進行了全外顯子測序。

1 資料與方法

1.1 研究對象 患者男性，年齡63歲，病程20年，1994年出現尿糖升高，行OGTT檢查確診為2型糖尿病，診斷標準參照2010年美國糖尿病協會公布的糖尿病診斷標準。2008年尿生化檢查尿蛋白升高，診斷為DN（DN診斷標準為：有糖尿病病史且尿微量白蛋白/肌酐>300mg/g，除外原發性腎小球病和其他繼發性腎小球疾病），在DN早期和中晚期兩次行腎活檢檢查，病理表現均為糖尿病腎損害，確診為糖尿病腎病，行眼底鏡檢查發現視網膜病變，同時伴有周圍神經病變。自2005年起采用胰島素治療，目前該患者已發展為終末期腎病，采用血液透析治療。本次研究調查和取樣均征得受試者同意并簽署了知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用高鹽法（北京百泰克生物技術公司，全血基因組DN提取試劑盒）提取外周血白細胞基因組DNA，應用Nanodrop2000/2000c分光光度計測定樣品DNA濃度及OD值（A260/280，A260/230），記錄樣品濃度和純度后-80℃儲存備用。

1.2.2 全基因組外顯子測序 采用AgilentSureSelect Human Kit芯片對DNA樣品進行外顯子捕獲，樣品外顯子文庫建立后通過Hiseq2000高通量雙末端測序平臺進行測序。輸出的原始數據（Reads）用SOAPaligner2.20與參考基因序列（NCBIbuid36.3，hg18）比對，通過 SOAPsnp（v1.03）得到外顯子及側翼區域SNP位點數據。

1.2.3 候選基因篩選 首先篩選出非同義突變（non-synonymous，NS）和剪切位點（splice acceptor and donor，SS）突變，將這些可能引起功能改變的突變（NS/SS）和公共數據庫 YH、dbSNP129、8HapMap外顯子組、千人基因組計劃進行逐步對比過濾，篩除已報道的基因多態性位點。由于無義突變對基因功能的影響更加明顯，所以選出無義突變進行基因功能分析。

1.2.4 免疫組化 采用過氧化物酶標記的鏈霉卵白素（streptavidin/peroxidase，SP）法對患者腎活檢組織切片進行免疫組織化學染色，研究基因FUT6（Abcam）的表達量。

2 結果

2.1 外顯子測序結果 利用Hiseq2000新一代高通量雙末端測序平臺，對1例病理確診的糖尿病腎病患者的全基因組外顯子進行NS/SS突變分析，得到外顯子及側翼區域SNP數據庫，見表1。

表1 樣本外顯子SNP檢測結果Tab1 Summary of SNPs for exom e capture sample

2.2 外顯子濾過結果 在測序結果中選出患者的NS和SS這些突變相比同義突變和非編碼區突變對基因功能的影響更為顯著。NS/SS突變經過公共數據庫YH、dbSNP129、8HapMap外顯子組和千人基因組外顯子組數據逐步過濾，排除多態性，最后發現有509個突變不存在于這些數據庫中（表2），其中包括497個錯義突變和12個無義突變。對12個存在無義突變的基因（表3）在腎臟的表達情況進行生物信息學分析（genome.ucsc.edu），發現在腎臟高表達的基因有ANKRD35、ACSM2A、FUT6和HAAO。

表2 突變濾過過程和結果Tab2 Variant prioritization pipeline

表3 樣本無義突變概況Tab3 Summary of nonsensemutations

2.3 免疫組化結果 考慮突變位點的Support、Score、expression和基因功能分析，選取FUT6基因進行研究，免疫組化檢測FUT6基因在該患者腎臟的表達，可以明顯看出FUT6主要在腎小管表達，患者FUT6表達與正常人比較明顯下降（圖1）。

圖1 DN患者與正常人腎組織FUT6表達水平（×400）Fig1 Theexpression levelofFUT6in DNpatientsandnorm alperso n（×400）

3 討論

DN不僅是糖尿病患者的主要死亡原因，同樣也是導致終末期腎病的主要原因之一，大量資料表明遺傳因素在DN的發生和發展中起關鍵性作用。隨著人類基因組計劃（Human genome project，HGP）和人類基因組單體型圖計劃（the international haplotypemap project，HapMap）的相繼完成，高通量測序技術的飛速發展，對個體全基因組或外顯子序列進行測序，可獲得完整的全基因組或外顯子變異位點圖譜，研究與疾病相關的基因。目前多項研究顯示外顯子測序在孟德爾疾病的研究中取得了重大突破，證實外顯子測序發現孟德爾疾病的致病基因是有效和可行的[4-5]。

DN的確診有賴于腎組織病理學檢查，20世紀50年代以來，許多學者致力于DN病理結構的研究，Tervaert等[6]在2010年將T1DN和T2DN的組織學改變進行統一的病理分級，分別對腎小球、腎小管和腎血管損害進行評估，但國際仍未形成統一的病理分級。目前臨床對DN的診斷和分級依據尿微量白蛋白，這與糖尿病合并腎臟疾病的患者很難區分，而糖尿病患者很少做腎活檢，所以目前臨床對DN的診斷并未十分明確。本研究以1例DN早期腎組織病理未見明顯異常但出現TGF-β1、TGF-βR1和Smad3的表達升高，經臨床和病理分析確診的DN患者作為研究對象，對其進行全基因組外顯子測序，以尋找與DN發病相關的致病基因，進一步較為全面的了解DN的遺傳背景。

FUT6（巖藻糖基轉移酶-6）基因定位于19p13.3，編碼α-1,3-巖藻糖基轉移酶的成員之一，催化巖藻糖基由GDP-α-L-Fuc轉移至糖鏈外側N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）3 位上的 FucT[7]，其主要的功能是合成Lewis系抗原（Lewisa和Lewisx）和唾液酸化的Lewis系相關抗原（sLewisa和sLewisx），在腫瘤的發生和發展中起重要作用[8-9]。本研究中，患者FUT6基因的堿基發生315TAC>TAA突變，使得氨基酸殘基由酪氨酸突變為終止密碼子，翻譯提前終止。Mollicone[10]在研究血清缺乏α-1，3－巖藻糖基轉移酶的印尼人家系時也發現了該突變位點的存在，證明了FUT6基因發生315Try>stop突變時，血清α－1，3－巖藻糖基轉移酶缺乏，從而影響其功能。有研究報道缺乏糖基化修飾的TGF-βR2幾乎不與TGF-β1結合[11]，具體的調節機制并不是十分明確，但Kim[12]用免疫熒光的方法證明TGF-βR2的糖基化修飾影響其在細胞表面的定位，從而影響與TGF-β1的結合，進而影響其功能，這說明TGF-βR2的糖基化修飾是TGF-β1致纖維化的必要條件。Hirakawa[13]在研究 α－1，3F UTs對結腸癌細胞的生物學行為的影響時發現，用siRNA干擾FUT6和FUT3后TGF-βR1和TGF-βR2的巖藻糖基化修飾明顯減少，Western blot發現 E-cadherin、pHSP27 和 pP38的表達明顯下降，曾有報道E-cadherin[14]和pP38[15]在TGF-β介導的上皮間充質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）中有重要作用，EMT 是腎臟纖維化的重要過程[16]，由此可以認為FUT6對TGF-βRs的巖藻糖基化修飾可能在腎間質纖維化過程中起到重要作用。

目前沒有發現DN遵循一種明確的孟德爾遺傳模式，認為是多種遺傳因素和環境因素共同作用的結果。本次研究對一早期還未出現腎臟功能性改變，但免疫組化證實有TGF-β、TGF-βR1和Smad3高表達的DN患者的全外顯子進行測序，結合基因功能學分析發現基因FUT6的終止突變，免疫組化證實在該患者的腎活檢標本中FUT6的表達下降。但目前尚缺乏直接證據表明FUT6終止突變與早期出現的TGF-β/Smad信號通路的激活有直接的聯系，需要進一步分子生物學實驗對其致病的具體機制進行研究。另外候選致病基因還需進行相關病例疾病驗證和種系突變檢測，以明確其在該疾病中的發生率。

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