應用組織芯片技術檢測mTOR和VEGF在結腸癌中的表達1

高碩徽

【摘 要】目的：探討雷帕霉素靶蛋白（mTOR）與血管內皮生長因子（VEGF）在臨床結腸癌患者中的表達，并針對兩者與結腸癌病理參數之間存在的關聯性。方法：選取72例結腸癌標本的組織芯片，采用免疫組化對mTOR以及VEGF進行檢測，經過結果分析兩者在結腸癌狀態下與正常結腸組織中的表達，同時根據結果對mTOR、VEGF與結腸癌臨床參數之間存在的關聯性進行統計分析。結果：mTOR在結腸癌中的總表達率為42.5%，在正常結腸黏膜組織中的表達率為21.3%；VEGF在結腸癌中的總表達率為60.2%，在正常結腸黏膜組織中的表達率為40.4%，mTOR與VEGF在結腸癌當中的表達率明顯高于在正常結腸黏膜組織中的表達率，比較差異具有統計學意義（P<0.05）。mTOR表達率與性別、年齡等患者基本資料之間無明顯的相關性，但mTOR與VEGF在淋巴結轉移情況、腫瘤浸潤深度等情況呈明顯的正相關性，mTOR與VEGF之間也存在明顯的正相關性。結論：mTOR與VEGF可作為結腸癌發展中的重要指標進行觀察，同時mTOR與VEGF也可以作為結腸癌的靶點應用于臨床當中。

【關鍵詞】雷帕霉素靶蛋白；血管內皮生長因子；結腸癌；組織芯片；免疫組化

Abstract：objective：to investigate the rapamycin target protein（mTOR）and vascular endothelial growth factor（VEGF）expression in clinical patients with colon cancer，and for the correlation between pathological parameters with colon cancer.Methods：choose 72 cases of colon cancer specimens of tissue microarray，of the mTOR and VEGF by immunohistochemical detection，through the analysis of both in the condition of colon cancer and normal colon tissue expression，at the same time，according to the results of mTOR，correlation between VEGF and colon cancer clinical parameters were analyzed.Results：the total expression of mTOR in colon cancer at a rate of 42.5%，in the normal colonic mucosa tissue expression rate is 21.3%；Total expression of VEGF in colon cancer at a rate of 60.2%，in the normal colonic mucosa tissue expression rate is 40.4%，mTOR and the expression rate of VEGF in colorectal cancer were significantly higher than those in normal colonic mucosa tissue expression rate of comparative differences statistically significant（P < 0.05）.MTOR expression rate of patients with gender，age and other basic data have no obvious correlation between，but mTOR and VEGF in lymph node metastasis，tumor infiltration depth，and so on and so forth are obvious positive correlation，also exist obvious positive correlation between mTOR and VEGF.Conclusion：the mTOR and VEGF can be used as an important index to observe in colon cancer development，at the same time mTOR and VEGF can also be used as a target for clinical application of colon cancer.

Key words：rapamycin target protein；Vascular endothelial growth factor；Colon cancer；Tissue chip；immunohistochemical

近些年來結腸癌發病率的上升，主要是由于人們生活方式的改變，更多的食物擺上了餐桌，其中包含的大量致結腸癌物質使得結腸癌位于目前致死惡性腫瘤第5位的排名。據我國維生組織的統計結果表明，全球范圍內的結腸癌發病率以每年3%的速度逐年遞增，而我國則以每年4%的速度增加[1]。在以往針對結腸癌發生與發展的研究當中，認為結腸癌與多個步驟、多個癌基因、多個抑癌基因以及調控信號通路的異常變化之間有顯著的相關性，多基因、多因素與多步驟成為了結腸癌特殊的發病機理。mTOR與VEGF是目前世界上生物學研究當中惡性腫瘤的研究熱點之一，mTOR的作用在于能夠感受營養信號，進而對細胞的生長與增殖能夠起到關鍵的促進作用，在多種惡性腫瘤發生與發展的過程當中均存在明顯的相關性與高表達率。本次研究采用免疫組織化學檢驗與組織微陣列針對mTOR與VEGF在結腸癌及正常結腸粘膜組織中的表達情況進行研究，進而探討結腸癌生物學相關行為的臨床意義。

1 材料及方法

1.1 標本選取

選取2011年-2015年某院實驗室當中的72例結腸癌石蠟標本作為本次的研究對象，所有標本均通過2名以上的專業病理醫師檢查并確診，另外選取原發癌灶邊緣>2cm的正常結腸粘膜組織作為參照物。

1.2 組織芯片

在石蠟標本組織蠟塊的選取當中，采用HE切片并針對具有代表性的病變部位進行確認，同時區分原發癌灶與正常粘膜組織，隨后采用應用芯片組織構建儀對組織芯片進行制備。

1.3 檢測方法

抗mTOR抗體選自英國ABcam公司（Dilution，1：50；Clone Y391），抗VEGF抗體選自美國Lab Vision公司（Dilution，1：200；Clone SP28），免疫組化試劑盒選取丹麥Dako公司的EnVision免疫組化試劑盒，采用EnVision二步法作為本次研究中的免疫組化技術，采用PBS代替一抗進行陰性對照[2]。

1.4 結果判斷標準

mTOR主要存在于細胞漿當中，而VEGF則在細胞質與細胞漿當中均可定位，經染色后陽性標本呈淡黃色、棕褐色或棕黃色。陽性細胞數計分標準采用二級計分法，對5個高倍鏡的視野對陽性細胞數進行統計：陽性細胞數<5%時，計0分；25%>陽性細胞數>5%時，計1分；50%>陽性細胞數>25%時，計2分；75%>陽性細胞數>50%時，計3分；陽性細胞數≥75%時，計4分。對染色強度進行分類后采用二級計分法，對染色后的陽性細胞進行統計：細胞呈淡黃色時，計1分；細胞呈黃色或深黃色時，計2分；細胞呈褐色或棕褐色時，計3分。將上述兩組標準統計后的積分相乘，>1分時即可判定為陽性[3]。

1.5 統計學處理

本次研究當中的所有數據均采用SPSS17.0統計學軟件進行處理，計數資料采用數（n）率（%）表示，數據相關性采用Spearman相關性檢驗。

2 結果

2.1 構建組織芯片

本次研究當中共構建成功1張組織芯片，其中包含了143個位點，脫落點采用常規切片予以補充。在癌組織當中，mTOR與VEGF染色的陽性細胞均呈片狀并大面積出現，mTOR在細胞漿中表達率較高，且呈強陽性，正常結腸粘膜組織經染色后不著色，部分細胞呈弱陽性。VEGF在細胞漿與細胞質當中均表達率較高，且呈強陽性，正常結腸粘膜組織經染色后不著色。

表1 mTOR及VEGF陽性表達與結腸癌臨床病理參數的相關性[n（%）]

臨床參數 病例數 mTOR+ VEGF+

性別

男 45 20（44.44） 27（60.00）

女 27 13（48.15） 19（70.37）

年齡

<60 39 15（38.46） 23（58.97）

≥60 33 18（54.55） 21（63.64）

浸潤深度

粘膜層與肌層 29 11（37.93）* 15（51.72）*

漿膜層及漿膜外 43 23（53.49） 31（72.09）

淋巴結轉移

陽性 34 21（61.76）* 30（88.24）**

陰性 38 14（36.84） 16（42.11）

遠處轉移

陽性 24 21（87.50）** 19（79.17）**

陰性 48 12（24.00） 23（47.92）

注：*P<0.05，**P<0.01。

2.2 原發癌與正常結腸粘膜組織中mTOR與VEGF的表達率

mTOR在結腸癌組織當中的表達率為42.5%，可隨著腫瘤的發生與發展逐漸增加，在正常結腸粘膜組織中的表達率為21.3%；VEGF在結腸癌組織當中的表達率為60.2，在正常結腸粘膜組織中的表達率為40.4%。結腸癌組織中的mTOR與VEGF的表達率均明顯高于在正常結腸粘膜組織中的表達率，比較差異具有統計學意義（P<0.05）。

2.3 mTOR與VEGF陽性表達與結腸癌臨床病理參數的相關性

mTOR表達率與患者的性別、年齡均無明顯的關聯性，與惡性腫瘤的淋巴結轉移及遠處轉移、浸潤深度均呈明顯的正相關性，VEGF表達率與惡性腫瘤的淋巴結轉移及遠處轉移、浸潤深度呈明顯的正相關性，具體數據見表1。

2.4 mTOR與VEGF的相關性

經Spearman相關性檢驗結果顯示，mTOR與VEGF之間存在顯著的相關性。mTOR與VEGF在結腸癌當中的共同表達率為37.8%（r=0.351，P<0.05），結果表明兩者之間存在明顯的正相關性。

3 討論

mTOR屬于蘇氨酸激酶/絲氨酸的一種，在營養信號的感受、細胞生長與增值當中具有極強的調節作用，通常情況下，細胞的增長與能量狀態、血液供給情況以及營養等因素具有極強的相關性，mTOR能將這些因素進行整合，對細胞的生長進行調節[4]。與正常細胞相同的是，癌細胞的成長也需要能量、營養以及血液的供給，因此VEGF存在的介導生物學作用在惡性腫瘤的發生與發展過程當中能夠起到重要的作用[5]。本次研究結果表明，在正常的結腸粘膜組織當中，mTOR基本不表達，在惡性腫瘤組織當中，mTOR的表達率為42.5%，而VEGF在惡性腫瘤組織當中的表達率則高達60.2%，mTOR與VEGF之間也存在明顯的正相關。

本次研究針對mTOR與VEGF在結腸癌的發生、發展以及轉移當中據存在明顯的作用，在臨床研究中不僅能夠對結腸癌的發生、轉移機制進行深入的了解，同時也能成為惡性腫瘤的待選治療靶點，在臨床當中具有重要的實際價值與意義。

參考文獻：

[1]王強，鄭海濤，丁德祥.結直腸癌的流行病學和篩查進展[J].中國現代醫生，2010，46（18）：103-104.

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