三氧化二砷介導Notch途徑抑制膠質瘤干細胞增殖

孫慶喜 李丕學

摘要：目的： 探討膠質瘤干細胞在膠質瘤的生成和復發過程中的作用。方法： 在本研究中我們通過體內和體外實驗證實三氧化二砷（As2O3）對膠質瘤干細胞具有抑制作用，利用免疫熒光技術和流式細胞技術，檢測三個膠質瘤細胞系（U87MG，U251MG和U373MG）被As2O3處理72h后Nestin蛋白表達變化；利用軟膠懸浮培養技術檢測腫瘤細胞系神經球形成變化；利用免疫缺陷鼠檢測腫瘤移植物生成變化；利用Western印記分析檢測腫瘤細胞系Notch1和Hes1蛋白表達變化。結果： As2O3（2μM）能將膠質瘤細胞系U87MG、U251MG和U373MG中的膠質瘤干細胞分別減少12%、14%和7%，抑制腫瘤移植物在免疫缺陷鼠中生成和U87MG細胞系生成神經球，通過免疫印跡分析我們發現伴隨膠質瘤干細胞的抑制Notch1和Hes1蛋白減少。結論： As2O3對膠質瘤干細胞具有明顯的抑制作用，其機制為Notch途徑活性的下調。

關鍵詞：膠質瘤；癌干細胞；三氧化二砷

膠質瘤對放化療具有抵制作用，所以極易復發。然而，通過對治療抵制機制的研究，一小群膠質瘤干細胞在此過程中發揮重要作用，從而使膠質瘤的復發率明顯下降[1，2]。全新的針對膠質瘤干細胞的治療方案受到廣泛關注。盡管最近一些報道稱膠質瘤干細胞對放化療具有抵制作用，但是，通過對信號途徑的調節一些藥物已經表現出對膠質瘤干細胞具有抑制作用[3，4]。例如，cyclopamine通過阻斷Hedgehog信號通路能減少膠質瘤干細胞[5]。

在本研究中我們檢測了As2O3抑制膠質瘤干細胞的作用。我們的結論是低劑量的As2O3即能抑制膠質瘤干細胞增殖。同時，我們也分析了可能的機制，發現Notch信號通路的下調是As2O3抑制膠質瘤干細胞增殖的重要機制。我們的數據證實As2O3通過下調Notch信號通路能抑制膠質瘤干細胞的增殖。

材料和方法

1.藥物

As2O3來自哈爾濱醫科大學附屬第一醫院藥劑科，應用PBS將As2O3稀釋成五個不同濃度（1，2，4，8和16μM）用于體內和體外實驗。

2.細胞培養

U87MG，U251MG和U373MG三個膠質瘤細胞系被培養在含10%胎牛血清的DMEM中。利用細胞計數系統（CT02，CHEMICON）檢測As2O3對細胞增殖的抑制效果。使用MTT法對細胞增殖分析進行評估[20]。簡單地說，每孔含有100μl培養基的96孔板中加入1×104個細胞，培養4h后加入各種濃度的As2O3，然后培養24-72h吸除培養液加入WST-8（四唑氮鹽），在37℃條件下培養30分鐘后，應用分光光度儀在570nm波長下測量每個孔的吸光光度值，吸光光度值與細胞數量相對應并不受As2O3的影響，以對照孔為基礎計算細胞的增值率，繪制劑量依賴性曲線和計算半數致死劑量，實驗被重復三次。

3.流式細胞儀

三個膠質瘤細胞系（U87MG，U251MG和U373MG）被As2O3處理72h后，應用Nestin-FITC抗體（R&D System），根據產品說明書做染色，染色后的細胞應用FACS （BD Cor.）進行分析，數據用WinMDI 2.87分析，結果應用ModFit LT 3.1（Verity）證實。

4.免疫熒光染色

培養細胞經2μM和4μM As2O3 處理72h后，應用4%的多聚甲醛固定15分鐘，0.2% Triton X-100透化10分鐘，蛋白阻斷劑（Thermo）培養5分鐘，1：200稀釋的Nestin 單克隆抗體（MAB5326， CHEMICON）4℃過夜，1：20稀釋的FITC二抗（DakoCytomation） 室溫1h，最后應用DAPI（Sigma）染色，被標記的細胞應用共聚焦顯微鏡分析。

在凋亡的實驗中細胞被2μM和4μM As2O3 處理24h，應用鼠的Nestin單克隆抗體（CHEMICON）和兔的Caspase-3多克隆抗體（CHEMICON），二抗分別為FITC （CHEMICON） 和PE（Sigma）。

結 果

1. As2O3抑制膠質瘤細胞的增殖

為了確定As2O3是否能抑制膠質瘤細胞增殖，我們檢測了它對U87MG、U251MG和U373MG三個膠質瘤細胞系抑制效果。這些細胞被1、2、4、8和16μM As2O3處理72h，應用MTT法揭示了As2O3的劑量依賴性抑制效果。依據細胞系的不同其對As2O3的敏感度也不同，半數致死劑量分別為1.9、2.4和3.0μM（Fig.1）。這些結果展示了As2O3能在體外有效地抑制這三種細胞的增殖，接近半數致死劑量（2μM和4μM）的As2O3被用于余下的實驗。

2.As2O3能減少Nestin（+）膠質瘤細胞的百分率

在U87MG、U251MG和U373MG三個膠質瘤細胞系中，Nestin（+）細胞的百分率分別為89%、88%和98%（Fig.2）。根據流式細胞儀和免疫染色的結果，經不同濃度As2O3（2、4、8和16μM ）處理后Nestin（+）腫瘤細胞的百分率明顯下降。代表膠質瘤干細Nestin（+）細胞在U87MG腫瘤細胞系中由89%分別下降到78%（2μM ）和68%（4μM），同樣，U251MG由88%下降到76%和64%，U373MG由98%下降到91%和58%。這些結果都說明，在這三個膠質瘤細胞系中As2O3能減少Nestin（+）腫瘤細胞，也就是說As2O3能抑制這三個膠質瘤細胞系的增殖，這些結果也促使我去探尋As2O3抑制膠質瘤干細胞的機制。

3.神經球形成分析

接下來我們檢測了As2O3在體外抑制腫瘤生成的效果。首先，通過克隆形成分析我們檢測了U87MG是否能形成孤立的神經克隆，然后，將U87MG細胞喂養在含軟膠培養皿中，平均每個視野下可形成41個神經克?。‵ig.3），同樣數量經2μM和4μMAs2O3處理后的活細胞在同樣軟膠培養條件下，形成神經克隆的數量分別為21個和5個，8μM As2O3能更加明顯地減少神經克隆的形成。

4.腫瘤移植物形成分析

為了確定As2O3對腫瘤移植物形成的影響，三個膠質瘤細胞系（U87MG、U251MG和U373MG）被As2O3（2μM和4μM）處理72h后，應用臺盼藍染色計數有活力的細胞，每組50萬個有活力的細胞被注入裸鼠皮下，再對照側有大的腫瘤移植物形成，相反，在處理組側僅有較小或沒有腫瘤移植物形成（Fig.4）。這些結果說明U87MG、U251MG和U373MG細胞的腫瘤形成能力可被低濃度的As2O3所抑制。

討 論

最近，與腫瘤起源和生存相關的癌癥干細胞被認為是腫瘤的發生和復發的重要原因[2]。而且，一些報道稱這些細胞對傳統的放化療具有抵制作用[3，4]。因此，尋找有效的治療策略成為研究的熱點。低劑量的As2O3能使急性早幼粒細胞白血病患者得到完全緩解[15]，抑制APL干細胞增殖[17]，所以，As2O3被認為能去除APL中的癌癥干細胞。然而，As2O3是否能去除膠質瘤中的癌癥干細胞仍是未知。在本研究中我們檢測了As2O3對U87MG、U251MG和U373MG三種膠質瘤細胞系的膠質瘤干細胞的抑制效果，發現，在體外低劑量的As2O3能抑制Nestin（+）細胞的增殖，而且，能明顯抑制腫瘤克隆的形成，同時有效地抑制腫瘤移植物在裸鼠體內的形成。本實驗第一次說明了As2O3能抑制膠質瘤細胞系中的癌癥干細胞。同時，我們觀察到經As2O3處理的腫瘤細胞中Notch1和Hes1蛋白明顯下降，說明Notch信號通路的下調參與了As2O3對膠質瘤干細胞的抑制過程，這些結果都說明As2O3能克服化療抵制對膠質瘤干細胞發揮抑制作用。

在體內和體外低濃度的As2O3都能抑制U87MG、U251MG和U373MG細胞的增殖說明，此藥物可以被考慮進行進一步的動物實驗，以能真正用于臨床治療膠質瘤患者。而且，本研究第一次說明了As2O3誘導膠質瘤干細胞抑制的機制。下一步實驗我們將證實其它機制的存在，例如Notch信號通路與其它信號通路之間的相互作用以及As2O3誘導的自噬。

總之，As2O3誘導的Notch信號通路阻滯抑制了膠質瘤干細胞的增殖，因此，As2O3能有效地抑制膠質瘤的生長。這個結論為進一步研究As2O3在臨床上治療膠質瘤提供了理論基礎。

參考文獻：

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