應(yīng)用組織芯片技術(shù)檢測(cè)mTOR和VEGF在結(jié)腸癌中的表達(dá)

【摘 要】目的：探討雷帕霉素靶蛋白（mTOR）與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）在臨床結(jié)腸癌患者中的表達(dá)，并針對(duì)兩者與結(jié)腸癌病理參數(shù)之間存在的關(guān)聯(lián)性。方法：選取72例結(jié)腸癌標(biāo)本的組織芯片，采用免疫組化對(duì)mTOR以及VEGF進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)過結(jié)果分析兩者在結(jié)腸癌狀態(tài)下與正常結(jié)腸組織中的表達(dá)，同時(shí)根據(jù)結(jié)果對(duì)mTOR、VEGF與結(jié)腸癌臨床參數(shù)之間存在的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：mTOR在結(jié)腸癌中的總表達(dá)率為42.5%，在正常結(jié)腸黏膜組織中的表達(dá)率為21.3%；VEGF在結(jié)腸癌中的總表達(dá)率為60.2%，在正常結(jié)腸黏膜組織中的表達(dá)率為40.4%，mTOR與VEGF在結(jié)腸癌當(dāng)中的表達(dá)率明顯高于在正常結(jié)腸黏膜組織中的表達(dá)率，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。mTOR表達(dá)率與性別、年齡等患者基本資料之間無明顯的相關(guān)性，但mTOR與VEGF在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤浸潤(rùn)深度等情況呈明顯的正相關(guān)性，mTOR與VEGF之間也存在明顯的正相關(guān)性。結(jié)論：mTOR與VEGF可作為結(jié)腸癌發(fā)展中的重要指標(biāo)進(jìn)行觀察，同時(shí)mTOR與VEGF也可以作為結(jié)腸癌的靶點(diǎn)應(yīng)用于臨床當(dāng)中。

【關(guān)鍵詞】雷帕霉素靶蛋白；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；結(jié)腸癌；組織芯片；免疫組化

Abstract：objective：to investigate the rapamycin target protein（mTOR）and vascular endothelial growth factor（VEGF）expression in clinical patients with colon cancer，and for the correlation between pathological parameters with colon cancer.Methods：choose 72 cases of colon cancer specimens of tissue microarray，of the mTOR and VEGF by immunohistochemical detection，through the analysis of both in the condition of colon cancer and normal colon tissue expression，at the same time，according to the results of mTOR，correlation between VEGF and colon cancer clinical parameters were analyzed.Results：the total expression of mTOR in colon cancer at a rate of 42.5%，in the normal colonic mucosa tissue expression rate is 21.3%；Total expression of VEGF in colon cancer at a rate of 60.2%，in the normal colonic mucosa tissue expression rate is 40.4%，mTOR and the expression rate of VEGF in colorectal cancer were significantly higher than those in normal colonic mucosa tissue expression rate of comparative differences statistically significant（P < 0.05）.MTOR expression rate of patients with gender，age and other basic data have no obvious correlation between，but mTOR and VEGF in lymph node metastasis，tumor infiltration depth，and so on and so forth are obvious positive correlation，also exist obvious positive correlation between mTOR and VEGF.Conclusion：the mTOR and VEGF can be used as an important index to observe in colon cancer development，at the same time mTOR and VEGF can also be used as a target for clinical application of colon cancer.

Key words：rapamycin target protein；Vascular endothelial growth factor；Colon cancer；Tissue chip；immunohistochemical

近些年來結(jié)腸癌發(fā)病率的上升，主要是由于人們生活方式的改變，更多的食物擺上了餐桌，其中包含的大量致結(jié)腸癌物質(zhì)使得結(jié)腸癌位于目前致死惡性腫瘤第5位的排名。據(jù)我國(guó)維生組織的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，全球范圍內(nèi)的結(jié)腸癌發(fā)病率以每年3%的速度逐年遞增，而我國(guó)則以每年4%的速度增加[1]。在以往針對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生與發(fā)展的研究當(dāng)中，認(rèn)為結(jié)腸癌與多個(gè)步驟、多個(gè)癌基因、多個(gè)抑癌基因以及調(diào)控信號(hào)通路的異常變化之間有顯著的相關(guān)性，多基因、多因素與多步驟成為了結(jié)腸癌特殊的發(fā)病機(jī)理。mTOR與VEGF是目前世界上生物學(xué)研究當(dāng)中惡性腫瘤的研究熱點(diǎn)之一，mTOR的作用在于能夠感受營(yíng)養(yǎng)信號(hào)，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖能夠起到關(guān)鍵的促進(jìn)作用，在多種惡性腫瘤發(fā)生與發(fā)展的過程當(dāng)中均存在明顯的相關(guān)性與高表達(dá)率。本次研究采用免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)與組織微陣列針對(duì)mTOR與VEGF在結(jié)腸癌及正常結(jié)腸粘膜組織中的表達(dá)情況進(jìn)行研究，進(jìn)而探討結(jié)腸癌生物學(xué)相關(guān)行為的臨床意義。

1 材料及方法

1.1 標(biāo)本選取

選取2011年-2015年某院實(shí)驗(yàn)室當(dāng)中的72例結(jié)腸癌石蠟標(biāo)本作為本次的研究對(duì)象，所有標(biāo)本均通過2名以上的專業(yè)病理醫(yī)師檢查并確診，另外選取原發(fā)癌灶邊緣>2cm的正常結(jié)腸粘膜組織作為參照物。

1.2 組織芯片

在石蠟標(biāo)本組織蠟塊的選取當(dāng)中，采用HE切片并針對(duì)具有代表性的病變部位進(jìn)行確認(rèn)，同時(shí)區(qū)分原發(fā)癌灶與正常粘膜組織，隨后采用應(yīng)用芯片組織構(gòu)建儀對(duì)組織芯片進(jìn)行制備。

1.3 檢測(cè)方法

抗mTOR抗體選自英國(guó)ABcam公司（Dilution，1：50；Clone Y391），抗VEGF抗體選自美國(guó)Lab Vision公司（Dilution，1：200；Clone SP28），免疫組化試劑盒選取丹麥Dako公司的EnVision免疫組化試劑盒，采用EnVision二步法作為本次研究中的免疫組化技術(shù)，采用PBS代替一抗進(jìn)行陰性對(duì)照[2]。

1.4 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

mTOR主要存在于細(xì)胞漿當(dāng)中，而VEGF則在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞漿當(dāng)中均可定位，經(jīng)染色后陽性標(biāo)本呈淡黃色、棕褐色或棕黃色。陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)采用二級(jí)計(jì)分法，對(duì)5個(gè)高倍鏡的視野對(duì)陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)：陽性細(xì)胞數(shù)<5%時(shí)，計(jì)0分；25%>陽性細(xì)胞數(shù)>5%時(shí)，計(jì)1分；50%>陽性細(xì)胞數(shù)>25%時(shí)，計(jì)2分；75%>陽性細(xì)胞數(shù)>50%時(shí)，計(jì)3分；陽性細(xì)胞數(shù)≥75%時(shí)，計(jì)4分。對(duì)染色強(qiáng)度進(jìn)行分類后采用二級(jí)計(jì)分法，對(duì)染色后的陽性細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)：細(xì)胞呈淡黃色時(shí)，計(jì)1分；細(xì)胞呈黃色或深黃色時(shí)，計(jì)2分；細(xì)胞呈褐色或棕褐色時(shí)，計(jì)3分。將上述兩組標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)后的積分相乘，>1分時(shí)即可判定為陽性[3]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本次研究當(dāng)中的所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料采用數(shù)（n）率（%）表示，數(shù)據(jù)相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建組織芯片

本次研究當(dāng)中共構(gòu)建成功1張組織芯片，其中包含了143個(gè)位點(diǎn)，脫落點(diǎn)采用常規(guī)切片予以補(bǔ)充。在癌組織當(dāng)中，mTOR與VEGF染色的陽性細(xì)胞均呈片狀并大面積出現(xiàn)，mTOR在細(xì)胞漿中表達(dá)率較高，且呈強(qiáng)陽性，正常結(jié)腸粘膜組織經(jīng)染色后不著色，部分細(xì)胞呈弱陽性。VEGF在細(xì)胞漿與細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中均表達(dá)率較高，且呈強(qiáng)陽性，正常結(jié)腸粘膜組織經(jīng)染色后不著色。

2.2 原發(fā)癌與正常結(jié)腸粘膜組織中mTOR與VEGF的表達(dá)率

mTOR在結(jié)腸癌組織當(dāng)中的表達(dá)率為42.5%，可隨著腫瘤的發(fā)生與發(fā)展逐漸增加，在正常結(jié)腸粘膜組織中的表達(dá)率為21.3%；VEGF在結(jié)腸癌組織當(dāng)中的表達(dá)率為60.2，在正常結(jié)腸粘膜組織中的表達(dá)率為40.4%。結(jié)腸癌組織中的mTOR與VEGF的表達(dá)率均明顯高于在正常結(jié)腸粘膜組織中的表達(dá)率，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 mTOR與VEGF陽性表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

mTOR表達(dá)率與患者的性別、年齡均無明顯的關(guān)聯(lián)性，與惡性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度均呈明顯的正相關(guān)性，VEGF表達(dá)率與惡性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度呈明顯的正相關(guān)性，具體數(shù)據(jù)見表1。

2.4 mTOR與VEGF的相關(guān)性

經(jīng)Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，mTOR與VEGF之間存在顯著的相關(guān)性。mTOR與VEGF在結(jié)腸癌當(dāng)中的共同表達(dá)率為37.8%（r=0.351，P<0.05），結(jié)果表明兩者之間存在明顯的正相關(guān)性。

表1 mTOR及VEGF陽性表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性[n（%）]

臨床參數(shù) 病例數(shù) mTOR+ VEGF+

性別

男 45 20（44.44） 27（60.00）

女 27 13（48.15） 19（70.37）

年齡

<60 39 15（38.46） 23（58.97）

≥60 33 18（54.55） 21（63.64）

浸潤(rùn)深度

粘膜層與肌層 29 11（37.93）* 15（51.72）*

漿膜層及漿膜外 43 23（53.49） 31（72.09）

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

陽性 34 21（61.76）* 30（88.24）**

陰性 38 14（36.84） 16（42.11）

遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移

陽性 24 21（87.50）** 19（79.17）**

陰性 48 12（24.00） 23（47.92）

注：*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

mTOR屬于蘇氨酸激酶/絲氨酸的一種，在營(yíng)養(yǎng)信號(hào)的感受、細(xì)胞生長(zhǎng)與增值當(dāng)中具有極強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用，通常情況下，細(xì)胞的增長(zhǎng)與能量狀態(tài)、血液供給情況以及營(yíng)養(yǎng)等因素具有極強(qiáng)的相關(guān)性，mTOR能將這些因素進(jìn)行整合，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)節(jié)[4]。與正常細(xì)胞相同的是，癌細(xì)胞的成長(zhǎng)也需要能量、營(yíng)養(yǎng)以及血液的供給，因此VEGF存在的介導(dǎo)生物學(xué)作用在惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程當(dāng)中能夠起到重要的作用[5]。本次研究結(jié)果表明，在正常的結(jié)腸粘膜組織當(dāng)中，mTOR基本不表達(dá)，在惡性腫瘤組織當(dāng)中，mTOR的表達(dá)率為42.5%，而VEGF在惡性腫瘤組織當(dāng)中的表達(dá)率則高達(dá)60.2%，mTOR與VEGF之間也存在明顯的正相關(guān)。

本次研究針對(duì)mTOR與VEGF在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移當(dāng)中據(jù)存在明顯的作用，在臨床研究中不僅能夠?qū)Y(jié)腸癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行深入的了解，同時(shí)也能成為惡性腫瘤的待選治療靶點(diǎn)，在臨床當(dāng)中具有重要的實(shí)際價(jià)值與意義。

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項(xiàng)目名稱：檢測(cè)mTOR蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及靶向抑制藥物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的作用機(jī)理，項(xiàng)目來源：吉林省科技廳，項(xiàng)目編碼：3D512J803430，項(xiàng)目負(fù)責(zé)人：高碩徽。