PEG10診斷HCV相關性肝硬化和肝癌效果評價

張海　胡亞華　朱燕莉　常城 李丹　余力群

PEG10診斷HCV相關性肝硬化和肝癌效果評價

張海胡亞華朱燕莉常城 李丹余力群

目的評價PEG10對慢性丙型肝炎（HCV）相關性肝硬化和肝細胞癌（HCC）的診斷價值。方法 選擇HCV患者67例，根據臨床診斷分為單純慢性HCV組23例、肝硬化組25例和HCC組19例，收集患者性別、年齡、Child-Pugh分級、ALT、AST和血清AFP等信息，同時采用RT-PCR法檢測外周血PEG10 mRNA水平。結果 AFP的ROC曲線下面積（AUC）為0.768，當231 ng/mL為AFP診斷HCC的界值時，敏感度和特異度分別為52.63％和93.75％，PEG10 mRNA的AUC為0.880，最佳診斷界值為2.09，此時敏感度和特異度分別為84.21％和87.50％，PEG10診斷效能稍高于AFP，但差異無統計學意義（P＜0.05）；PEG10 mRNA水平與HCC患者性別、腫瘤數目、腫瘤大小和轉移情況均不相關（P ＞0.05）。結論 PEG10 mRNA在HCC患者的水平明顯高于慢性HCV和肝硬化，同時PEG10 mRNA與腫瘤大小、數目、臨床分期均不相關，是一種理想的HCC診斷指標。

PEG10；HCV；肝硬化；原發性肝癌

肝細胞癌（HCC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，死亡率極高［1］。在我國大多數HCC系由乙型肝炎病毒（HBV）所致，近年丙型肝炎后肝硬化有上升的趨勢，與HBV和其他病因引起的HCC相比，丙型肝炎病毒（HCV）相關性HCC多發生于老齡患者，自然病程相對較長，腫瘤進展較緩慢，也有研究認為HCV相關性 HCC較其他原因預后更差［2］，因此提高HCC的早期診斷率一直是學界關注的焦點。印跡基因父系表達基因10（Patemally expressed gene 10，PEGl0）是新發現的遺傳印跡基因，在絕大多數人肝癌組織及肝癌細胞系中高表達，同時患者外周血中PEG10m RNA表達升高，對HCC早期診斷有重要價值［3］，但對HCV相關性HCC判斷意義尚未見報道。本研究納入67例慢性HCV、丙型肝炎后肝硬化和HCC患者，檢測外周血PEG10 mRNA表達差異，評價PEG10對HCV相關性肝硬化和HCC的診斷價值。

資料和方法

一、研究對象

收集2011年5月至2014年11月間在我院經體格檢查、血清學、組織病理學和影像學確診的病例，所有患者根據診斷分為慢性HCV組（Metavir評分≤F3）、肝硬化組（Metavir評分為F4）和HCC組（根據2011年版原發性肝癌診療規范）［4］，收集完整的臨床資料，包括患者性別、年齡、Child-Pugh分級、ALT、AST、Edmonson臨床分期和血清AFP等；病理學資料包括腫瘤大小、數目、肝外轉移情況等。

二、試劑與儀器

試劑：Ficoll外周血淋巴細胞分離液（中國醫學科學院生物工程研究所，天津），總RNA提取試劑盒（Qiagen，德國），Super-ScriptⅢ逆轉錄試劑盒（QIAGENLtd，美國），實時熒光定量PCR試劑SYBR Premix Ex Taq和DEPC水（Ta KaRa，日本），PBS液（Gibco，美國），無水乙醇（國產分析純）。

儀器：DU800紫外分光光度計（Nano Vue-Health care Bio-SciencesAB，德國），低溫高速離心機Eppendorf Centrifuge 5810R、5415R（Eppendorf，德國），Gene Amp PCR System 2400、7900 HT Sequence DetectionSystem（ABI，美國）。PCR儀：Roche Molecular Biochemicals Light Cycler-Gmb H D-68298（德國）。自動電泳凝膠成像分析儀：G-BOX，SYNYENE，SYOR4/1246（美國）。

三、檢測PEGl0 mRNA表達［5］

分離外周血單個核細胞：每位受試者抽取2 m L靜脈血，以EDTA抗凝，常溫下加緩沖液PBS對倍稀釋，將稀釋血液緩慢加入Ficoll分離液中，分離外周血單個核細胞（PBMC）；2000 r/min離心15 min；吸出細胞層，加約10倍的PBS液，混勻；l500 r/min離心5 min；棄上清，加PBS重懸細胞，l500 r/min離心3 min，棄上清，備用。

引物設計與合成：根據NCBI Genbank中PEGl0 mRNA全長序列（基因序列號：NM015068）采用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計，由上海生工公司合成，引物序列上游：TTG TCC ACG AAA CTC ACG，下游：TGT CCA CTG GGAATA CTG，退火溫度51.3℃，片段長度403 bp，

總RNA制備及純度和濃度測定：按試劑盒說明書步驟操作以溶解抽提總RNA。提取的RNA用紫外分光光度計測定A260/A280，二者比值為1.8～2.0證實RNA純度良好，低于1.8者重新提取RNA。每份RNA經過3次獨立檢測，如誤差在允許范圍內，則取平均濃度作為最終確定的濃度，稀釋至1μg/μL并分裝，-80℃保存。

逆轉錄cDNA合成：逆轉錄反應按lnvitrogen公司SuperSciptⅢ逆轉錄試劑盒說明書將總RNA轉錄為cDNA。工作液含RT bufier、Mgcl2、DTT、RNaseOUT、

SuperScript，加RNA模板，oligo（d T）作為引物，反應條件為30℃10 min，42℃30 min，99℃5 min，5℃5 min，逆轉錄完成后得c DNA，置-20℃保存。

FQ RT-PCR檢測：PCR反應體系為10×PCR緩沖液12.5μL，采用SYBRR Premix Ex Taq TM熒光定量PCR試劑盒，取c DNA樣品1.5μL，d NTPS 0.5 μL，引物0.2μL，反應條件為94℃3 min，隨后94℃30 s，52℃40 s，72℃40 s，35個循環，最后延伸72℃7 min。擴增產物1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外光照顯帶。

記錄結果：每份標本以PEGl0基因和內參基因βactin各重復3孔，每份樣本的目的基因和內參基因分別設立空白對照。采用樣點擬合法分析結果，得到樣本中PEGl0的循環閾值（Ct）值，PEG10 m RNA的相對表達量用2-△△Ct方法計算。

四、診斷效率評價

采用ROC曲線比較PEGl0 mRNA和AFP對肝硬化和HCC的診斷效率，并計算最佳診斷界點時的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比、陰性似然比、正確診斷指數。

五、統計學方法

以SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均值±標準差描述，組間比較采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析，計數資料以百分率描述，組間比較采用χ2檢驗，均以P＜0.05為差異有統計學意義。采用Med Calc軟件（Mariakerke，Belgium）生成ROC曲線，分別評價AFP和PEG10對肝硬化和HCC的診斷能力。

結　果

一、一般情況

符合入選標準的患者共67例，其中單純慢性HCV23例，肝硬化25例，HCC19例；HCC組年齡、AFP和PEG10 mRNA均明顯高于其他兩組（P＜0.05），而慢性HCV和肝硬化患者組間無明顯差異（P＞0.05）；性別、Child-Pugh分級、ALT和AST組間比較無明顯差異（P＞0.05），見表1。

表1　各組人口學及病史資料組間比較

二、PEG10與AFP預測HCC價值比較

PEG10和AFP預測的ROC曲線下面積（AUC）分別為0.880和0.768（Z=6.806和4.046，P＜0.0001）；敏感度分別為84.21％和52.63％，特異度分別為87.50％和93.75％，組間比較無差異（AUC差值為0.112，Z=1.351，P=0.177），見表2、圖1。

表2　PEGl0 mRNA和AFP單項檢測診斷效率的相關參數

圖1ROC曲線

三、PEG10 m RNA與患者性別、腫瘤數目、腫瘤大小和Edmonson分級關系分析

PEG10 mRNA水平與HCC患者性別、腫瘤數目、腫瘤大小和轉移情況均不相關（P＞0.05），見表3。

表3　PEG10 mRNA與患者性別、腫瘤數目、腫瘤大小和轉移情況關系

討　論

HCC是臨床常見惡性腫瘤，由于診斷多為晚期，預后極差。為提高HCC的早期診斷率，國內外學者做了大量的研究，篩選出AFP、GPC3、MDK、SERPINI1、QP-C和PEG10等大量的生物標記物［6］，其中AFP是目前臨床上診斷HCC最常用的生物標記物，但該指標只在60％～70％的HCC患者中出現升高，而在小肝癌中陽性率更加低至33％～65％［7］，同時在慢性肝炎和肝硬化患者中，血清AFP同樣出現升高［8］，因此尋找敏感性和特異性更高的診斷指標，特別是對于AFP正常或小肝癌患者具有重要的臨床意義。

循環腫瘤細胞（CTCs）是指自發或因診療操作進入血液循環的腫瘤細胞，可以在血液中進行檢測，很多研究都在強調CTCs的存在和數量對腫瘤診斷和預后的判斷價值［9，10］。血液是CTCs存在的微環境，且外周血取材無創、方便，為動態直觀地了解病情變化打開了一扇窗戶［11］。雖然肝組織活檢對HCC診斷的準確率更高，但肝臟活檢操作難度較大，相比而言外周血的檢測技術更容易在臨床推廣。但是實體瘤分子生物學機制十分復雜，難以找到一種可靠的DNA異常能代表一類腫瘤，因此目前CTCs的檢測多用于血液系統的惡性腫瘤［10］。既往的研究發現，PEG10基因具有更高的肝癌組織特異性，在相應的癌旁組織、正常肝組織中以及其它非肝臟來源的腫瘤細胞中均不表達，國內外均有研究探索PEG10 m RNA與HCC患者的CTCs數量的相關性，取得肯定的結果［12］。目前用于分離CTCs的方法有很多種，相比血細胞計算和免疫組化法，Ficoll密度梯度離心法簡便、低廉和較高的恢復率在臨床上應用最廣泛，而RTPCR可以間接通過檢測DNA或mRNA來反映CTCs的存在，具有較高的可信度［13］，因此本研究采用上述兩種方法進行檢測。

本研究中HCC組性別有明顯差異，男性患者HCC發生率遠高于女性患者，這與男性更容易暴露于嗜酒、吸煙和病毒感染的危險因素有關，同時雌激素對肝癌細胞的發生有抑制作用［6］。肝硬化組和HCC組患者年齡無明顯差異，但明顯高于HCV組，這與中國人群丙型肝炎年齡分布接近，大部分的丙型肝炎患者年齡段位于30～39歲之間［14］，該現象也符合HCC的病理進展，HCV經過10～30年的發展后容易形成HCC［15］。肝硬化患者在Child分級中均勻分布，而由于加入本篩查研究，HCC在早期即被發現而未進展至晚期。雖然本研究中大多數患者AFP＜200 ng/m L，但由于HCC腫瘤細胞能大量分泌AFP，HCC組患者仍明顯高于非HCC組，表現出中等強度的診斷效能，稍低于PEG10，但由于樣本量較少，差異無統計學意義［16］，而兩指標在慢性HCV和肝硬化組間均無差異，無法對兩種疾病進行鑒別，結果與同類研究相近［17］。本研究中，PEG10表達與腫瘤大小、數目、臨床分期均無明顯的相關性，類似的結果國內外均有報道［3］，表明包括小肝癌病例在內的大多數HCC患者中均有PEG10表達，適用于HCC的早期篩查。

綜上所述，PEG10 mRNA在HCC患者的水平明顯高于慢性HCV和肝硬化，同時PEG10 mRNA與腫瘤大小、數目、臨床分期均不相關，是一種理想的HCC診斷指標。

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2015-04-01）

（本文編輯：易玲）

2013-2014年度湖北省衛生廳科研指導性項目（JX6C-48）

435000 湖北 黃石市中心醫院（湖北理工學院附屬醫院）消化內科（張海，胡亞華，朱燕莉，常城，余力群），科教科（李丹）

朱燕莉，Email：33575296@qq.com