乙型肝炎肝衰竭患者血清細胞因子與肝功能指標的關系

白潔　王曉霞

乙型肝炎肝衰竭患者血清細胞因子與肝功能指標的關系

白潔王曉霞

目的探討患有慢加急性乙型肝炎肝衰竭（ACHBLF）的患者體內輔助性T細胞1/2（Th1/Th2）所分泌的細胞因子的含量，并探討其含量變化在ACHBLF中的作用。方法 收集17例本院體檢中心健康志愿者，35例患有ACHBLF以及18例患有慢性乙型肝炎（CHB）的患者的血清，利用流式細胞微球芯片捕獲技術（CBA）檢測血清中腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細胞介素4（IL4）、γ干擾素（IFNγ）、白細胞介素10（IL10）、白介素2（IL2）以及白介素6（IL6）的含量，并且分析ACHBLF患者血清內Th1/Th2細胞因子的變化情況。結果 健康對照組以及CHB組外周血循環中的IFNγ、IL4、TNFα以及IL6較ACHBLF顯著降低（P=0.016、0.020、0.017、0.018）。IL2和IL10在健康組和CHB組中的含量與ACHBLF患者中的含量相比，差異沒有統計學意義（P＞0.05）。ACHBLF患者血清中的凝血酶原活動度（PTA）、總膽紅素（TBil）以及白蛋白（Alb）的含量與IFNγ、IL4、IL6以及TNFα的含量之間沒有顯著的相關性（P＞0.05）。結論 可能ACHBLF患者病情發展與血清中的細胞因子IL6、IFNγ、IL 4以及TNFα有一定的相關性，沒有發現肝功能與上述細胞因子之間的相關關系。CBA可以應用于對各種細胞因子的檢測。

慢加急性乙型肝炎肝衰竭；流式細胞微球芯片捕獲技術；細胞因子

慢加急性乙型肝炎肝衰竭（ACHBLF），即由慢性乙型肝炎（CHB）發展而成的急性肝衰竭，屬于重型慢性乙型肝炎。ACHBLF的病死率高達70％，是慢性重型肝炎中比較常見的一種疾病，通常起病急，預后差。ACHBLF的具體發病機制目前尚未闡明，但是相當復雜，很多的ACHBLF患者都是由于感染病毒，病毒在機體內活動活躍，使機體的免疫力下降，繼而產生大面積的炎癥反應，進而導致病情加重。在機體免疫應答中發揮重要作用的輔助性T細胞（Th），通過誘導其它重要的免疫細胞的活化而在機體中發揮重要的作用。Th細胞可以分為兩個亞群，Th1和Th2亞群，這兩個亞群的細胞在正常情況下處于一定的平衡狀態，Th1、Th2分泌的細胞因子相互抑制，使彼此都不會大幅度的升高或者降低。但是在病理情況下Th1、Th2常失衡。近年來，有研究發現，肝細胞免疫損傷與乙型肝炎病毒（HBV）的持續性感染以及Th1、Th2的失衡有關。但目前對Th1、Th2產生的細胞因子的研究多采用酶聯免疫吸附實驗（ELISA），該方法樣本需求量很大，每次又只能檢測一種因子，無法真實地反映各種細胞因子之間的聯系。現代化的研究需要一種更加高效，低用量的方法來對細胞因子進行檢測。流式細胞微球芯片捕獲術（cytometric beadar ray，CBA）高通量、精確性高，最大的優點是可以同時檢測很多種細胞因子。本研究通過運用CBA檢測患者Th1，Th2分泌的細胞因子的含量來探究患有ACHBLF患者的肝功能指標與細胞因子變化的聯系。

資料和方法

一、臨床資料

收集2014年1月到12月本院患有ACHBLF的患者35例，女6例，男29例。CHB患者18例，女8例，男10例。另外收集本院體檢中心的17名健康志愿者作為對照組，女7名，男10名。患者入院3 d后清晨空腹取靜脈血，檢測其HBV DNA，血液學，HBV血清學標志物以及肝功能等相關指標。排除標準為藥物性肝病，病毒感染，自身免疫性疾病，酒精性肝病，原發性肝癌、惡性腫瘤以及合并甲、丙、戊型肝炎病毒感染。所有參與研究的志愿者以及患者，須確保在3個月內沒有使用過免疫調節藥物。

二、研究方法

將Th1/Th2細胞因子的標準品溶解在2.0 m L稀釋液中，在室溫靜置15 min以后稀釋。稀釋方法：取300μL的稀釋液加入300μL的標準液，混勻，此時就是進行了1∶2稀釋。使用倍比稀釋依次進行1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256以及1∶512的倍數進行稀釋。將6種捕獲了細胞因子的磁珠等體積混勻，取50μL于分析管里。依次加入50μL標準品、50μL血清樣本以及50μL藻紅蛋白，混勻以后避光室溫放置3 h。再加入1 m L的洗液，200×g離心5 min。加入300μL的洗液使磁珠懸浮，上儀器前震蕩3～5 s。分析采集的圖譜用Cell Quest軟件，而將分析結果換算成濃度則使用BD FACSComp軟件。Alb、ALT、TBil、PTA等均在本院檢驗中心檢測，而HBV DNA以及HBV血清學標志物等均在本實驗室進行檢驗。

三、統計學分析

使用GraphPad Prism 5進行統計分析。使用ANOVA方差分析進行組間比較，運用（ˉx±s）的形式表示正態分布資料，用Pearson的方法進行臨床指標與細胞因子的相關性分析。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

結　果

一、健康對照者及患者的基本臨床資料

對健康對照組、CHB組與ACHBLF組患者的臨床資料進行比較。在TBil、ALT以及HBV DNA方面的比較結果顯示，ACHBLF組的血清中TBil、ALT的含量明顯高于健康對照組和CHB組（P=0.023、0.012），HBV DNA低于其它兩組（P＜0.001），見表1。

表1　健康對照者及患者臨床基本資料

二、健康對照組、CHB組以及ACHBLF組血清中Th1、Th2細胞因子含量的變化

標準品共9個濃度點，整個過程由計算機自動處理，曲線的適配度在95％以上，曲線見圖1。

三、CBA檢測健康對照者與患者細胞因子濃度對照

對健康對照組、CHB組與ACHBLF組患者的血清細胞因子濃度進行比較。在IL10、IL6、IFNγ、TNFα、IL2以及IL4等方面的比較結果顯示，ACHBLF組的血清中含量明顯高于健康對照組和CHB組（P=0.014、0.018、0.016、0.017、0.015、0.020），見表2。

四、ACHBLF患者血清中的IFNγ、TNFα及IL4、IL6與TBil、Alb及PTA的相關性分析

ACHBLF患者中，反映肝功能與血清內IFNγ、TNFα及IL4、IL6的含量無顯著相關性（P＞0.05）。對TBil、Alb、PTA分別與IFNγ、IL4、IL6、TNFα的相關性進行了Spearman分析，統計結果見表3。

圖1Th1、Th2細胞因子擬合曲線

表2　CBA檢測健康對照與患者細胞因子濃度

表3ACHBLF患者血清中IFNγ、TNFα及IL4、IL6 與TBil、Alb及PTA相關數據的r值

討　論

T淋巴細胞可以被分為不同種類，相同的種類又可以分為不同亞群［1］。不同種類的細胞之間依靠所分泌細胞因子的不同而相互促進，相互制約，包括調節性T細胞（Treg）、Th2和Th1［2］。T淋巴細胞還在宿主移植排異、感染性及很多自身免疫性疾病的發生發展中具有重要的意義。近年來，已經有很多研究表明，HBV和HCV的感染過程中有T淋巴細胞的參與，且在HBV感染中影響頗大的Th1和Th2可能影響HBV感染后機體的結局［3］。

細胞因子在抵抗內源性以及外源性的抗原和調節機體自身的狀態需求時起到非常重要的作用。細胞因子是由體內的細胞合成以及分泌的多肽。現在檢測細胞因子的技術有3種：（1）分子雜交檢測；（2）生物活性檢測；（3）免疫學直接定量細胞因子［4］。目前最常用的檢測方法是ELISA，因生物活性檢測以及雜交檢測要求的實驗條件較高，不是所有的實驗室均能滿足其所需條件。ELISA具有經濟，操作簡單等優點，但同時也有缺點，它樣本需求量大，精確性低，且1次只能檢測1種細胞因子，耗時耗力。CBA是一種多重蛋白的液相定量檢測技術，其基本原理為：首先要形成捕獲微球，具體做法是在微球上包被捕獲的不同熒光強度的抗體，接著和樣本溶液混合，樣本中能與微球上的抗體特異性結合的蛋白或者抗原就會結合到微球上，然后加入已經熒光標記過的檢測抗體，最后放上流式細胞儀對其進行檢測［5］。和傳統的ELISA法相比，CBA具有很多優點：（1）所需的樣本量大大降低，為傳統檢測的1/6；（2）可以同時檢測很多種蛋白，因它是分別針對不同的抗體，且使用了在熒光強度方面各有不同的微球群；（3）穩定性好，有效避免了酶聯放大技術容易出現的假陽性［6］。

感染HBV的機體通過正常免疫應答來抵御HBV的繼續入侵。在受到抗原刺激后，T淋巴細胞立即分化為Th和細胞毒性T細胞（CTL）。CTL主要通過分泌TNFα以及IFNγ等來清除病毒，通過介導非溶解細胞途徑，另一方面也可以通過溶解受感染的細胞來清除靶病毒［7］。由于Th1細胞主要產生IL2以及IFNγ，Th1細胞占優勢時，有利于完全清除病毒［8］。Th2細胞分泌的IL4以及IL10等，可以介導體液免疫以及抑制Th1的細胞因子的產生，此時可以使病毒感染呈現緩慢的趨勢［9］。當機體的免疫應答異常以及病毒攻擊重癥肝炎患者時，患者體液免疫功能亢進、B淋巴細胞、T淋巴細胞以及單核巨噬細胞的活性增高。此時CTL細胞增殖分化增多，大量炎癥細胞，特別是中性粒細胞，浸潤肝組織，使大量的肝細胞出現壞死。

IL2必須與靶細胞膜表面的IL2受體raiL-2R結合才能發揮其正常的生物學功能［11］。患有ACHBLF的患者，細胞膜上sIL2R的含量與正常對照組相比顯著升高。sIL2R是活化的淋巴細胞膜上raiL-2R的a鏈，它和rai L-2R一樣，可以結合血液中的IL2，此時血液中的IL2本來含量已經降低，加上sIL2R的競爭結合作用，封閉了細胞因子，使免疫系統功能紊亂加劇，免疫功能更加低下，病情加重［12］。而HBV，HCV等的持續感染使機體產生更多sIL2R，使很多淋巴細胞又被活化，且這種活化效應是不正常的，會使病情惡化［12］。此時大量庫普弗細胞活躍增生，單核巨噬細胞大面積浸潤，IL6產生增多，而肝臟此時清除IL6的功能已經減弱，清除效果不理想。

在重癥肝炎中，IFNγ起到非常重要的作用。當Th1呈現優勢應答時，IFNγ的表達水平較高，是引起肝細胞壞死的重要原因。重癥肝炎時，TNFα不僅可以通過細胞免疫激活體內的單核巨噬細胞產生更多的TNFα，還可以激活CTL細胞，激活其殺傷作用［13］。此外，它還可以使內皮細胞損傷，通過中性粒細胞的粘附作用。本研究中，ACHBLF組患者的血清IFNγ以及TNFα顯著升高，而在CHB組以及健康對照組的血清中，IFNγ和TNFα的含量則非常低。通過分析，造成這一結果的原因可能是重癥肝炎時分泌了較多的IFNγ和TNFα，T細胞要清除病毒的感染，從而造成了大量肝細胞的損傷，也使HBV DNA的含量下降。另外一種可能的原因就是ACHBLF患者很容易合并感染，而TNFα是一種促炎因子，感染會使它的含量急劇升高［14］。TNFα和IL4相互協調，共同介導炎癥的發展，兩者共同升高可以反映全身或者局部感染存在［15］。本研究證實，肝炎時TNFα的血清濃度變化趨勢與IL6與IL4相同，可能是由于肝炎患者多合并全身或者局部的感染，促炎因子的升高，發生級聯瀑布反應，但具體原因還有待進一步觀察。

本研究分析了凝血因子全套指標以及肝功能衰竭指標ALb、TBil等與Th1、Th2細胞因子的關系，結果顯示兩者并無顯著的相關性（P＞0.05）。同時可能由于機體啟動了免疫反應，使促炎因子和免疫抑制因子含量急劇升高，使Th1、Th2的變化不完全符合規律。CBA的特異性以及敏感性，還需要進一步的驗證。同時上述假設還需要擴大病例進行研究。由于本研究僅限于分析外周血中細胞因子的變化情況，但是外周血中的細胞因子具有多源性，所以它的含量變化并不能直接反映肝臟中Th1、Th2細胞因子的含量變化情況，因此有待進一步檢測肝臟中細胞因子的含量來反映患者的細胞因子變化情況。

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2015-04-16）

（本文編輯：易玲）

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