膀胱癌干細胞的研究進展

張海洋等

[摘要] 膀胱癌是泌尿系統疾病中最常見的惡性腫瘤，具有治療后易復發的特性。腫瘤干細胞理論認為腫瘤干細胞是腫瘤發生、發展、復發和轉移的根源，這給癌癥的治療及研究提供了新的方向。成功分離出膀胱癌干細胞，并針對膀胱癌干細胞進行的靶向治療將成為膀胱癌治愈的一個重要途徑。人們對膀胱癌干細胞的生物學特性、分離和治療等方面進行了大量的研究，本文就關于膀胱癌干細胞的最新研究進展做一綜述。

[關鍵詞] 膀胱癌干細胞；生物學特性；分離；治療

[中圖分類號] R318 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）09（b）-0043-04

膀胱癌手術治療后易復發，目前的研究認為是由于膀胱癌干細胞的存在。腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSC）是指存在于腫瘤組織及腫瘤細胞系中具有自我更新能力、多向分化潛能并能產生異質性腫瘤細胞的細胞群體。腫瘤干細胞理論認為，腫瘤干細胞表面存在能排出化療藥物的分子泵，從而對化療藥物反應不敏感，與腫瘤的遠處器官轉移、耐藥性的產生和復發均有密切關系。只要腫瘤組織中存在少量的腫瘤干細胞，腫瘤就不可能被治愈，仍會復發。在泌尿生殖道腫瘤中，目前僅有前列腺癌腫瘤干細胞得到成功分離和鑒定[1-2]，膀胱癌干細胞的研究也有一定的進展。

1 膀胱癌干細胞的生物學特性

1.1 膀胱癌異質性

早在1970年開始，國外研究人員就已經發現膀胱癌腫瘤組織存在異質性，膀胱癌腫瘤組織中存在一小部分細胞能夠在體外形成克隆，而其他絕大多數腫瘤細胞不具備這樣的特性。

1.2 極強的致瘤能力

雖然腫瘤干細胞的含量極低，但其具有極強的致瘤能力，易形成克隆或動物體內成瘤，具有獨特的生物學特性。

1.3 自我更新并可多向分化的能力

國外學者研究將乳腺癌干細胞移植到裸鼠體內，可以生成乳腺癌全部的腫瘤組織病理類型，這說明乳腺癌腫瘤干細胞具有自我更新與多向分化的能力[3]。Gaisa等[4]利用雙色酶組織化學法證實尿路上皮中細胞色素氧化酶缺陷的區域存在相同的體細胞線粒體DNA變異，表明這些區域是一個克隆單位，包含尿路上皮中所有分化階段的細胞，此項研究證實在尿路組織中存在尿路上皮干細胞。

1.4 自我保護能力

細胞周期實驗證實，腫瘤干細胞通常處于靜止狀態，更多的腫瘤干細胞處于細胞周期的G0/G1期，而處于S期的細胞較少，并且具有較高的DNA修復能力，表達高水平的抗凋亡蛋白，而且過高表達ABCG2蛋白，其能將抗腫瘤藥物和細胞毒素泵出細胞外，從而逃避化療藥物的殺傷作用[5-6]。

2 膀胱癌干細胞的分離篩選

早在20世紀70年代，急性髓性白血病[7]的腫瘤干細胞是最先被發現及分離出來的，陸續地又有9種人類腫瘤干細胞被成功分離鑒定，但至今仍有大部分腫瘤干細胞還未被成功分離鑒定，其中包括膀胱癌腫瘤干細胞。國內有學者證實了膀胱癌初始細胞EMA-CD44v6+細胞具有膀胱癌干細胞的特性，間接地證明存在膀胱癌干細胞，但其仍沒有成功得到分離鑒定[8]。但研究者們從未放棄對膀胱癌干細胞的分離及鑒定的探索，并已取得了一定進展。

通常分離腫瘤干細胞的方法有三種。第一種是利用干細胞表面標志物，應用流式細胞儀和免疫磁珠分選法進行腫瘤干細胞的篩選，這種腫瘤干細胞分離方法也是最常用的，然而膀胱尿路上皮癌沒有特定的干細胞表面標志物[9]。Chan等[10]利用Lineage-CD44+CK5+CK20-標志物從原代膀胱癌細胞中成功分離出膀胱癌啟動細胞（bladder cancer-initiating cell），在小鼠體內形成移植瘤僅需要1×102～1×103個CD44+腫瘤細胞，并且能促進膀胱癌的進展。Yang等[8]研究利用干細胞表面標志物發現，膀胱癌組織中存在的CD44v6+EMA-MUC-細胞可能是膀胱癌干細胞。Tatokoro等[11]也通過實驗證實，膀胱移行細胞癌5637細胞株中的CD44+細胞亞群具有膀胱癌啟動細胞的相關特征，對化療藥物順鉑產生更強的耐藥抵抗力，并且表達更高的Akt和ERK分子致瘤性信號通路，使用熱休克蛋白90（HSP90）信號通路抑制劑可以顯著提高膀胱癌啟動細胞對化療藥物順鉑的敏感性。學者Su等[12]利用乙醛脫氫酶1（ALDH-1）從膀胱移行細胞癌組織中分離膀胱癌干細胞，發現ALDH-1的表達與膀胱癌患者特異性生存率和總生存率呈負相關。Atlasi等[13]在2007年首次報道了在膀胱癌細胞中存在高表達OCT-4干細胞標志物。Xu等[14]研究證實，膀胱癌組織中有少量能用全能干細胞標志物OCT-4成功標記的OCT-4陽性膀胱腫瘤細胞，這些OCT-4陽性腫瘤細胞被認為可能是膀胱癌干細胞。但是，這個全能干細胞表面標志物OCT-4并不是膀胱癌干細胞所特有的。所以試圖利用腫瘤干細胞表面標志物成功分離出膀胱癌干細胞的方法需要進一步探索研究。

第二種是利用無血清培養基（serum-free medium，SFM）即普通干細胞的培養基的方法分選膀胱癌干細胞，因胎牛血清中有促進干細胞分化的營養成分，為了避免腫瘤干細胞分化，采用無血清培養基分離腫瘤干細胞。腫瘤干細胞易呈懸浮球或微球體生長，并且可以連續傳代培養，形成的腫瘤微球體與親代腫瘤球具有相同的細胞生物學特性。有研究者發現，利用無血清培養基培養腦神經膠質瘤的腫瘤干細胞時，可以篩選、擴增并形成癌細胞球或微球體[15-16]，但同時這種方法會有大量的非腫瘤干細胞混入，致使分離出的腫瘤干細胞亞群純度不高，這也只能作為分離篩選腫瘤干細胞的輔助方法。曹正國等[17]從膀胱腫瘤組織中采用無血清懸浮培養法成功分離培養獲得膀胱癌干細胞樣細胞，其高表達PIWIL12蛋白。寧志豐等[18]也利用無血清懸浮培養從膀胱癌T24細胞株中分離出微球體，并驗證這些微球體有腫瘤干細胞的特點。

最后一種則是利用流式細胞儀分離側群細胞（SP）的方法。目前的研究認為，側群細胞是具有一定干細胞特性的一類細胞亞群，能夠有效地從細胞內泵出Hoechst 33342染料而不被染色的一小群細胞，普通正常細胞表面因沒有相關轉運蛋白而被染色，特別適用于沒有特異性干細胞表面標志物的腫瘤干細胞篩選[19]。Ning等[20]在2009年首次報道利用流式細胞術在3種膀胱移行細胞癌細胞系EJ、UM-UC-3、T24中篩選側群細胞，最后僅在膀胱癌細胞株T24中發現了34.7%的側群細胞，且這些篩選出的側群細胞中的絕大數處于細胞周期的G0/G1期、具有更強的生長增殖能力和克隆形成能力，對放療及化療均不敏感。但是，腫瘤干細胞理論認為，腫瘤干細胞在普通腫瘤細胞系中的比例小于10%，因此這種篩選側群細胞的方法仍不合適于用來分離膀胱癌干細胞，但至少，這也能說明膀胱癌T24細胞中可能含有膀胱癌干細胞，是研究膀胱癌干細胞較好的細胞模型。

雖然，目前利用以上三種實驗方法都無法成功分離出膀胱癌干細胞。但上述研究成果為以后實驗進行人膀胱癌干細胞樣細胞的分離和鑒定提供了重要的理論基礎和實驗方法。在2009年Tan等[21]率先利用化療藥物在小鼠荷瘤模型中分選出肝細胞癌腫瘤干細胞后，國內有學者也開始利用化療藥物絲裂霉素C從膀胱癌移行細胞癌T24細胞株中篩選耐藥細胞，驗證發現，剩余存在7.5%的耐藥細胞可能是膀胱癌干細胞[22]。Zhang等[23]用高濃度化療藥物順鉑篩選出的耐藥細胞被證實是膀胱癌干細胞樣細胞。這也為進行化療藥物結合無血清培養基技術分選出膀胱癌干細胞樣細胞提供了實驗依據。

3 膀胱癌干細胞的治療

腫瘤干細胞理論可以解釋臨床上應用化療藥物或和放射線治療腫瘤細胞的效果不理想的原因。普通的腫瘤細胞具有很強的增殖能力，持續地進行細胞增殖，常規的化學藥物治療或和放射治療能大量殺傷處于細胞周期增殖階段的腫瘤細胞。但腫瘤干細胞具有較強的自我更新能力，且多數腫瘤干細胞處于細胞周期的靜止期，其細胞表面具有分子泵相關蛋白，這些腫瘤干細胞表面的分子泵蛋白與正常干細胞一樣擁有排出化療藥物的功能，導致對化療藥物不敏感。所以腫瘤干細胞與正常干細胞都具有抵御化療與放射治療的能力[24]。從而使腫瘤干細胞自身逃逸了化療藥物毒性和放射線的殺傷。雖然如此，但研究人員沒有放棄抗腫瘤干細胞藥物的研發，針對腫瘤干細胞的化療藥物已經有了一定的發展。Gupta等[25]利用腫瘤干細胞成功篩選出抗乳腺癌的高效抗癌藥，研究發現，某些藥物能夠有選擇性地殺傷乳腺癌干細胞，如鹽霉素藥物作用乳腺癌干細胞時，能導致乳腺癌干細胞某些基因表達缺失，從而起到殺傷作用。Chan等[10]研究發現，免疫球蛋白樣跨膜整合素相關蛋白（IAP/CD47）幾乎在所有的膀胱癌細胞中表達，且CD47在膀胱癌干細胞表達顯著增高。使用單克隆抗體阻斷CD47信號通路可以在體外誘導巨噬細胞對膀胱癌細胞的吞噬作用。由此，CD47可能成為膀胱癌干細胞的一個潛在的治療靶點。目前腫瘤干細胞靶向治療的研究主要集中在表面標志物和相關信號傳導途徑的小分子抑制物[26]，而靶向治療聯合傳統治療對腫瘤干細胞將可能會有更好的療效。

4 結語與展望

膀胱癌具有手術治療后容易復發的特點，雖然術后輔助膀胱灌注化療可以在一定程度上降低復發可能性，但臨床治療中仍有較高的復發概率。惡性腫瘤細胞生長、轉移和復發的特點與干細胞的基本特性十分相似。應尋找更有效的方法分離膀胱癌干細胞，研發抑制膀胱癌干細胞自我更新的藥物，開展針對膀胱癌干細胞的治療。因此，尋找膀胱癌干細胞及其信號途徑中新的治療靶點將成為今后腫瘤研究的重點，更能為泌尿生殖系統腫瘤患者帶來治療的新曙光以及為臨床腫瘤治療提供新的方向和視覺角度。

[參考文獻]

[1] Nikitin AY，Nafus MG，Zhou ZX，et al. Prostate Stem Cells and Cancer in Animals [J].Cancer Drug Discovery and Development，2009，4：199-216.

[2] Collins AT，Berry PA，Hyde C，et al. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells [J].Cancer Res，2005，65（23）：10946-10951.

[3] Motzer RJ，Amsterdam A，Prieto V，et al. Teratoma with malignant transformation： diverse malignant histologies arising in men with germ cell tumors [J]. J Urol，1998，159（1）：133-138.

[4] Gaisa NT，Graham TA，Mcdonald SA，et al. The human urothelium consists of multiple clonal units，each maintained by a stem cell [J]. J Pathol，2011，225（2）：163-171.

[5] Reya T，Morrison SJ，Clarke MF，et al. Stem cells，cancer，and cancer stem cells [J]. Nature，2001，414（6859）：105-111.

[6] 周韜，方針強，周鋒，等.ABCG2在膀胱移行細胞癌中的表達及意義[J].重慶醫學，2009，38（23）：2954-2956.

[7] Bonnet D，Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell [J]. Nat Med，1997，3（7）：730-737.

[8] Yang YM，Chang JW. Bladder cancer initiating cells（BCICs）are among EMA-CD44v6+ subset：novel methods for isolating undetermined cancer stem（initiating）cells [J]. Cancer Invest，2008，26（7）：725-733.

[9] Wu C，Alman BA. Side population cells in human cancers [J].Cancer Lett，2008，268（1）：1-9.

[10] Chan KS，Espinosa I，Chao M，et al. Identification， molecular characterization，clinical prognosis， and therapeutic targeting of human bladder tumor-initiating cells [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（33）：14016-14021.

[11] Tatokoro M，Koga F，Yoshida S，et al. Potential role of Hsp90 inhibitors in overcoming cisplatin resistance of bladder cancer-initiating cells [J]. Int J Cancer，2012，131（4）：987-996.

[12] Su Y，Qiu Q，Zhang X，et al. Aldehyde dehydrogenase 1 A1-positive cell population is enriched in tumor-initiating cells and associated with progression of bladder cancer [J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2010，19（2）：327-337.

[13] Atlasi Y，Mowla SJ，Ziaee SA，et al. OCT-4，an embryonic stem cell marker， is highly expressed in bladder cancer [J]. Int J Cancer，2007，120（7）：1598-1602.

[14] Xu K，Zhu Z，Zeng F. Expression and significance of Oct4 in bladder cancer [J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2007，27（6）：675-677.

[15] Hemmati HD，Nakano I，Lazareff JA，et al. Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（25）：15178-15183.

[16] Galli R，Binda E，Orfanelli U，et al. Isolation and characterization of tumorigenic，stem-like neural precursors from human glioblastoma [J]. Cancer Res，2004，64（19）：7011-7021.

[17] 曹正國，田超，蔣茂林，等.人膀胱癌組織中腫瘤干細胞樣細胞的分離培養及PIWIL2表達[J].現代泌尿外科雜志，2012，17（4）：342-346.

[18] 寧志豐，武倩，司馬學琴，等.膀胱癌T24中腫瘤干細胞樣細胞的分離與鑒定[J].解剖學研究，2013（02）：131-134.

[19] Kondo T，Setoguchi T，Taga T. Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（3）：781-786.

[20] Ning ZF，Huang YJ，Lin TX，et al. Subpopulations of stem-like cells in side population cells from the human bladder transitional cell cancer cell line T24 [J]. J Int Med Res，2009，37（3）：621-630.

[21] Tan S，Chen JS，Sun LJ，et al. Selective enrichment of hepatocellular cancer stem cells by chemotherapy [J]. J Int Med Res，2009，37（4）：1046-1056.

[22] Li L，Li B，Shao J，et al. Chemotherapy sorting can be used to identify cancer stem cell populations [J]. Mol Biol Rep，2012，39（11）：9955-9963.

[23] Zhang Y，Wang Z，Yu J，et al. Cancer stem-like cells contribute to cisplatin resistance and progression in bladder cancer [J]. Cancer Lett，2012，322（1）：70-77.

[24] Collins AT，Berry PA，Hyde C，et al. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells [J]. Cancer Res，2005，65（23）：10946-10951.

[25] Gupta PB，Onder TT，Jiang G，et al. Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening [J]. Cell，2009，138（4）：645-659.

[26] Du X，Ho M，Pastan I. New immunotoxins targeting CD123，a stem cell antigen on acute myeloid leukemia cells [J]. J Immunother，2007，30（6）：607-613.

（收稿日期：2015-05-10 本文編輯：程 銘）