肝素-泊洛沙姆超聲微泡體外溶栓實驗

王艷，趙應征，唐琴琴

（1.浙江省中醫(yī)院 西藥房，浙江 杭州 310006；2.溫州醫(yī)科大學 藥學院，浙江 溫州 325035）

肝素-泊洛沙姆超聲微泡體外溶栓實驗

王艷1，趙應征2，唐琴琴2

（1.浙江省中醫(yī)院 西藥房，浙江 杭州 310006；2.溫州醫(yī)科大學 藥學院，浙江 溫州 325035）

目的：探討治療性超聲（US）介導結(jié)合肝素-泊洛沙姆（HP）的微泡（MB）對自制體外血栓的溶解作用及機制。方法：對兔耳緣靜脈進行取血，制備體外血栓，通過考察不同栓齡、超聲聲強（凈強度2～8 W/cm2）、作用時間和材料濃度下的栓溶率來確定各組的溶栓效應，并對其機制進行探討。實驗分組為：①US組；②US+MB組；③HP組；④US+HP組；⑤US+MB+HP組。結(jié)果：US+MB+HP組超聲所需時間最短，溶栓效果最好，而其余各組對于體外血栓也有一定溶解作用。結(jié)論：新合成的材料HP與超聲微泡聯(lián)合應用后溶栓效果明顯提高，其在臨床治療血栓性疾病中具有較好的應用潛力。

肝素-泊洛沙姆；超聲；微泡；溶栓

自1976年Trubestein等［1］首次使用血管內(nèi)高頻超聲溶解血栓獲得成功以來，超聲溶栓成為生物醫(yī)學超聲領(lǐng)域的重要研究課題。研究發(fā)現(xiàn)高能低頻超聲波能裂解體內(nèi)外動脈粥樣硬化斑塊和血栓［2］，栓溶率隨著血栓凝齡增加而降低［3］。利用微泡作造影劑，超聲可以監(jiān)測病變局部的血流異常。利用超聲波的照射作用，將微泡造影劑作為攜帶藥物或治療性基因的載體，可以實現(xiàn)藥物的靶向?qū)耄_到有效、快速、減少溶栓藥劑量以及減輕或避免不良反應的作用。因此，超聲微泡藥物運載系統(tǒng)在溶栓治療方面具有深遠的前景。國內(nèi)外許多實驗研究已經(jīng)證實超聲微泡具有血栓助溶作用，這種助溶作用一方面表現(xiàn)在微泡能夠有效增強超聲的溶栓作用，另一方面則表現(xiàn)在微泡可以增加溶栓藥物的作用，這就顯示出了超聲微泡聯(lián)合溶栓藥物治療方法的強力優(yōu)勢［4-5］。

本研究采用新合成的材料肝素-泊洛沙姆（HP），在前期已探討的該材料性質(zhì)的基礎(chǔ)上，通過進行體外自制血栓來進一步考察HP對血栓的作用，同時摸索HP結(jié)合超聲增強溶栓效果的一些參數(shù)。

1　材料和方法

1.1實驗動物 健康成年新西蘭大白兔12只，雄雌不限，體質(zhì)量1.8～2.5 kg，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2材料和儀器 肝素（批號：080311，效價：105.1 AxaIU/mg，河南常山生化藥業(yè)有限公司）；HP（由溫州醫(yī)科大學藥學院提供）；泊洛沙姆（批號：WPWA544C，德國BASF，進口分裝）；0.9%氯化鈉溶液（浙江康樂藥業(yè)）；MB（批號：090806E，由溫州醫(yī)科大學藥學院提供）；醫(yī)用超聲耦合劑（KL-250型，由溫州醫(yī)科大學院附屬第二醫(yī)院超聲科提供）；氯化鈣（AR，北京化工廠）；超聲儀（型號：K-628A）；電熱恒溫振蕩水槽（DKZ-450B型，上海森信實驗儀器有限公司）；電子天平（德國賽多利斯集團）；超聲探頭；24孔板；20 mL針筒；試管；刀片；秒表；EP管；移液槍。

1.3實驗方法

1.3.1體外血栓的制備：對兔耳緣靜脈進行采血置于EP管中，放入37 ℃恒溫水浴箱中，靜置一段時間，形成血凝塊后，用0.9%氯化鈉溶液沖洗3～4次，基本洗去附著的未凝血細胞，濾紙吸干，即得。

①栓徑的選擇：采用2、5、8 mm規(guī)格的模具制備了3種大小的血栓，通過幾次實驗，綜合考慮操作的便利性與栓徑變化的確切性，我們最終選擇栓徑大小為5 mm規(guī)格的血栓。

②栓齡的考察：根據(jù)體外血栓的制備方法，采取靜置時間分別為4、5、6、8、12、24、36、48、60 h，制備相應栓齡的血栓，考察超聲對不同栓齡血栓的消溶作用，確定合適的栓齡范圍。

1.3.2超聲溶栓技術(shù)參數(shù)的優(yōu)化：①超聲強度對栓塊的溶解：采用的超聲儀探頭面積為5 cm2，波輸出方式為脈沖，考察時間為5 min，超聲強度在2～8 W/cm2之間。超聲方法：將裝有0.9%氯化鈉溶液及血凝塊的24孔板置于37 ℃恒溫水槽中距液面約0.5 cm左右，保證板底無氣泡，使24孔板接受超聲作用，探頭表面置于各血栓處的孔板底部。設定超聲聲強為8、7、6、5、4、3、2 W/cm2，作用時間為5 min。然后取出孔板，將多余液體吸出，測栓徑，繼而計算栓徑的改變量。每個超聲強度重復實驗3次，記錄每個栓徑值，取3次重復實驗的平均值，用平均值對超聲強度作圖。②不同超聲強度在不同時間里對血栓的溶解：先制備相同栓齡及體積的血栓，置于37 ℃ 0.9%氯化鈉溶液中進行超聲脈沖式照射，超聲強度為2、3、4 W/cm2時，觀察不同時間（1、2、3、5 min時）超聲對栓徑的影響，對應每個時間重復實驗3次，記錄栓徑，并計算平均值，以該值與時間及超聲強度作圖，從而評價溶栓效果。③MB濃度對溶栓的影響：參考1.3.1制備相同栓齡及體積的血栓，并將其置于裝有0.9%氯化鈉溶液的24孔板中，然后設定超聲時間為1 min，超聲強度為3 W/cm2，超聲脈沖式照射，比較不同MB體積對栓塊的溶解效果。④藥物加入量對溶栓的影響：參考1.3.1制備相同栓齡及體積的血栓，并將其置于裝有0.9%氯化鈉溶液的24孔板中，然后設定超聲時間為1 min，超聲強度為3 W/cm2，加入MB體積為0.2 mL，比較不同藥物加入量對栓塊的溶解效果。

1.3.3HP相關(guān)性質(zhì)的考察：①HP的溶解性：泊洛沙姆是一類表面活性劑，由聚氧乙烯和聚氧丙烯聚合而成，其具有一定的溶解度，能溶于水，它能增加肝素的溶解度，增加與血栓的親和力。取少量HP，用少量0.9%氯化鈉溶液溶解，即成澄清溶液。②HP使用濃度的摸索：根據(jù)公式HP的濃度=（0.045× t-0.055）μmoL/mL計算即得。其中t為不加藥物所得的復鈣化時間。③肝素修飾化脂質(zhì)微泡凍干粉的制備：將氫化磷脂、泊洛沙姆、HP等材料按照一定比例在有機相中均勻分散，凍干（充入SF6氣體），得到肝素修飾化脂質(zhì)微泡凍干粉（白色，疏松粉末狀）。由于存在親水基團，復溶性較好。鏡檢：粒徑不太均勻、存在部分異形泡、少量聚集，平均粒徑（2.58±0.26）μm，平均數(shù)量（1.7±0.26）×108/mL，無磷脂碎屑。MB粒徑受體內(nèi)外條件的影響較小，助溶效果比較好［6-7］。

1.3.4不同干擾因素對血栓栓溶率的影響：設置超聲強度為3 W/cm2，超聲時間為1 min，微泡加入體積為0.2 mL，在HP的體積為0.4 mL的條件下，考察不同干擾因素對栓溶率的影響。

1.3.5復鈣化時間實驗：用0.9%氯化鈉溶液分別配置一定溶度的泊洛沙姆、HP、肝素溶液。各取3只試管溶液，分別加入血漿0.2 mL，CaCl2溶液（濃度為0.025 mol/L）0.2 mL，置于37 ℃水浴恒溫，記錄試管內(nèi)出現(xiàn)第一條絲纖狀物的時間，計算平均值。根據(jù)該數(shù)值，由公式HP的濃度=（0.045×t-0.055）μmoL/mL，計算所需HP濃度。

1.3.6HP的血液相容性：采用Lee-White實驗（全血凝血實驗），取潔凈玻璃試管分為3組，分別為泊洛沙姆組、HP組、肝素組，每組3個平行實驗。經(jīng)37 ℃水浴恒溫后，依次沿壁加入1 mL兔血于試管中，開始計時。3 min后每隔30 s傾斜試管，至試管中血液不流動計為凝血時間。

2　結(jié)果

2.1栓齡與血栓栓溶率的關(guān)系 如圖1所示，超聲栓溶率在4～60 h范圍內(nèi)的趨勢是隨著栓齡的增加而降低，且在6 h以內(nèi)超聲溶解血栓的效果最佳。結(jié)果表明臨床治療栓塞性疾病應該越早治療，效果越好。

圖1　栓齡和血栓溶栓率關(guān)系圖

2.2不同超聲強度對栓塊溶解的效果 如圖2所示，在超聲強度2～8 W/cm2范圍內(nèi)，隨著超聲強度的增加，栓徑大小呈現(xiàn)減小的現(xiàn)象。強度越大，栓溶作用越明顯。

圖2　超聲強度和栓徑關(guān)系圖

2.3超聲強度和超聲時間對溶栓的影響 不同超聲強度（2、3、4 W/cm2）和不同超聲時間（1、2、3、5 min）對血栓溶解的效果如圖3所示，血栓栓徑與超聲強度或超聲時間成反比，超聲強度越大或超聲時間越長，越有利于血栓的溶解。

圖3　超聲時間和栓徑相互關(guān)系圖

2.4微泡的加入對溶栓效果的影響 設定超聲時間為1 min，超聲強度為3 W/cm2，比較不同微泡體積對栓塊的溶解效果。如圖4所示，在一定的體積范圍內(nèi)（0～0.2 mL），隨著微泡體積增大，栓溶增加。但當達到一定體積后，栓溶變化不明顯。

圖4　不同微泡溶度與栓徑相互關(guān)系圖

2.5藥物HP的加入對溶栓的影響 超聲時間為1 min，超聲強度為3 W/cm2，微泡體積為0.2 mL，比較不同量的HP加入對栓塊的溶解效果。如圖5所示，在一定HP加入量范圍內(nèi)（0～0.5 mL），隨HP加入量增大，栓溶作用增加。

圖5　不同HP加入量與栓徑相互關(guān)系圖

2.6不同干擾因素對栓溶率的影響 如表1和圖6所示，超聲微泡聯(lián)合HP的栓溶作用最強，超聲與HP均具有一定程度的栓溶作用，微泡能增加超聲的栓溶作用。

圖6　體外溶栓效果圖

2.7 復鈣化結(jié)果 不加藥物的試管出現(xiàn)第一條絲狀物的時間為t1=11′03′，代入公式計算：HP溶度= （0.0045×t1-0.055）μmoL/mL

由上式計算得到HP溶度為2.9 μmoL/mL。復鈣化時間見表2，肝素組t2=16′04′，HP組平均時間t3= 19′42′，泊洛沙姆組平均時間t4=14′30′。HP對血栓形成有一定的抑制作用。

表1　不同干擾因素對栓溶率的影響（%）

表2　復鈣化時間記錄表

2.8全血凝血實驗結(jié)果 如表3所示，HP組的血液相容性比較好，能延緩血栓的形成。

表3　全血凝血時間記錄表（min）

3　討論

本研究所選血栓模型制備過程與已有報道結(jié)果基本相似。我們根據(jù)實驗結(jié)果及條件選用靜置凝血時間為5 h，實驗過程中證實該時間所形成的血凝塊穩(wěn)定，適合本實驗。

超聲波自身的生物物理特性使其不僅在診斷領(lǐng)域得到廣泛應用，在治療領(lǐng)域也展示出令人鼓舞的應用前景。本研究以不同超聲強度、不同照射時間的超聲波輻照體外血栓，有明確的溶栓效果，這與以往國內(nèi)外大多數(shù)實驗結(jié)果相符［8-9］。大多數(shù)研究者認為超聲溶栓可能與超聲波空化效應和機械效應有關(guān)，而與其熱效應無明顯關(guān)聯(lián)［10］。超聲波在組織和細胞內(nèi)可產(chǎn)生空化現(xiàn)象，可引發(fā)高達1～3個大氣壓的“內(nèi)爆炸”效應，足以使血栓在極短的時間內(nèi)碎解成細小的顆粒。此外，Porter等［11］的實驗證明，超聲波能使纖維蛋白分解產(chǎn)物D-二聚體增加，推測其可以增強纖維蛋白溶解。

研究中還涉及在固定超聲和照射時間的條件下，對不同栓齡的血栓進行實驗，所得溶栓結(jié)果與栓齡成反比，即栓齡越高，栓溶率則呈下降趨勢，這與以往實驗結(jié)果相符。因此，在安全能量范圍內(nèi)，尋求超聲的最佳溶栓效果已成為近年來研究的重點。在考察超聲強度對栓溶影響的實驗中，我們選擇超聲強度范圍為2～8 W/cm2。這是基于通過排除最大值和最小值，在較平穩(wěn)的范圍內(nèi)更好地考察變量，減少誤差［12］。在考察超聲時間對栓溶影響實驗中，綜合臨床治療栓塞性疾病中對時間要求的嚴格性，我們考察了0～6 min內(nèi)超聲的栓溶效果。在考察完超聲參數(shù)后，我們研究了新材料HP對栓溶的影響，以及在超聲系數(shù)的改變對栓溶促進作用影響不大的情況下，加入不同體積的微泡，栓溶作用發(fā)生改變，進而說明微泡能增加超聲的栓溶作用。我們綜合考察了超聲微泡和HP的相互作用，并發(fā)現(xiàn)三者聯(lián)用，溶栓效果最佳，其原因可能是空化作用后使血栓破裂的同時增加了HP與血栓的接觸面積，進而使栓溶作用進一步增加。總之，超聲具有一定的溶栓效應，超聲微泡聯(lián)合HP，在溶栓方面有協(xié)同作用，即強化HP溶栓效應，并可減少有效溶栓的HP劑量，從而減少大劑量溶栓藥物導致致命性出血并發(fā)癥的危險性。HP超聲微泡溶栓較單一溶栓藥物治療效果好［13］。隨著微泡制造技術(shù)的發(fā)展，HP超聲溶栓有望成為急性血管栓塞性疾病高效、無創(chuàng)的治療手段。

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（本文編輯：吳昔昔）

Ultrasound-microbubble mediated heparin-poloxamer thrombolysis study in vitro

WANG Yan1， ZHAO Yingzheng2， TANG Qinqin2.
1.Department of Pharmacy， Traditional Chinese Medicine Hospital of Zhejiang，Hangzhou， 310006； 2.School of Pharmacy， Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325035

Objective: To explore and discuss the mechanism of theapeutical ultrasound combined with heparin-poloxamer （HP） on thrombus dissolution in vitro. Methods: Blood clots were prepared from rabbit ear blood. Main factors on the thrombolysis effects in vitro were investigated， including blood clot age， ultrasonic intensity （pure intensity seted in the range of 2～8 W/cm2）， ultrasound time and material concentration. Five experimental groups were as follows: ①US； ②US+MB； ③HP； ④US+HP； ⑤US+MB+HP. Through the results of the experiment， thrombolysis effect in each group was determined and the mechanism was discussed. Results: The group （US+MB+HP） showed the best result in the thrombolysis with less ultrasound time， though the other groups showed certain thrombosis effects in vitro. Conclusion: Heparin-poloxamer combined with ultrasound microbubble has an improved effect in thrombolysis， which may be a potential technique for clinical treatment of thrombotic diseases.

heparin-poloxamer； ultrasound； microbubbles； thrombolysis

R94

B DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.11.011

2015-01-12

王艷（1987-），女，浙江建德人，初級藥師。

趙應征，教授，碩士生導師，Email：pharmtds@163. com。