MMPs、TIMPs及炎癥因子在習(xí)慣性流產(chǎn)孕婦中的表達

馬丹琦，梁丹，李愛金，楊麗珠，呂杰強

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325027；2.臺州市路橋區(qū)計劃生育宣傳技術(shù)指導(dǎo)站，浙江 臺州 318050；3.臺州恩澤醫(yī)療中心集團 婦產(chǎn)科，浙江 臺州 318050；4.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035）

MMPs、TIMPs及炎癥因子在習(xí)慣性流產(chǎn)孕婦中的表達

馬丹琦1，2，梁丹3，李愛金3，楊麗珠4，呂杰強1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325027；2.臺州市路橋區(qū)計劃生育宣傳技術(shù)指導(dǎo)站，浙江 臺州 318050；3.臺州恩澤醫(yī)療中心集團 婦產(chǎn)科，浙江 臺州 318050；4.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035）

目的：探討習(xí)慣性流產(chǎn)孕婦外周血和子宮內(nèi)膜中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）與氧化應(yīng)激及炎癥因子表達的意義。方法：收集2012年10月至2014年10月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院及臺州恩澤醫(yī)療中心集團婦產(chǎn)科收治的習(xí)慣性流產(chǎn)孕婦32例為觀察組，早孕人工流產(chǎn)孕婦35例為對照組。ELISA法測定外周血和子宮內(nèi)膜中MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1及子宮內(nèi)膜超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α），并作相關(guān)性分析。結(jié)果：與對照組比，觀察組血清MMP-2明顯下降（P＜0.05），MMP-9、TIMP-2明顯升高（P＜0.05），子宮內(nèi)膜MMP-2、MMP-9明顯下降（P＜0.01），TIMP-2明顯升高（P＜0.05）；觀察組子宮內(nèi)膜SOD明顯下降（P＜0.05），MDA、IL-6、TNF-α明顯升高（P＜0.05）；觀察組子宮內(nèi)膜MMP-2、MMP-9與SOD、GSH-PX呈正相關(guān)，TIMP-2與MDA、TNF-α呈正相關(guān)。結(jié)論：MMPs/TIMPs系統(tǒng)的失平衡及炎癥應(yīng)激的異常表達可能與習(xí)慣性流產(chǎn)相關(guān)。

習(xí)慣性流產(chǎn)；基質(zhì)金屬蛋白酶；金屬蛋白酶組織抑制劑；炎癥；氧化應(yīng)激

習(xí)慣性流產(chǎn)是婦產(chǎn)科常見妊娠并發(fā)癥之一，傳統(tǒng)觀念認(rèn)為習(xí)慣性流產(chǎn)發(fā)病與遺傳、內(nèi)分泌、子宮解剖異常、感染、免疫等因素有關(guān)［1-2］，但近年來的研究發(fā)現(xiàn)習(xí)慣性流產(chǎn)可能還和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallopr-oteinase，MMPs）及金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs）有關(guān)［3-4］。如國外學(xué)者Anumba等［3］研究發(fā)現(xiàn)TIMP-2與習(xí)慣性流產(chǎn)相關(guān)，Konacl等［4］推測MMP-2、MMP-9、TIMP-1在子宮內(nèi)膜中呈低表達而導(dǎo)致習(xí)慣性流產(chǎn)發(fā)生，提示了MMPs及TIMPs可能與習(xí)慣性流產(chǎn)相關(guān)。此外，有研究［5］報道炎癥應(yīng)激與MMPs的異常表達相關(guān)，而異常的炎癥應(yīng)激反應(yīng)也可能導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。本研究旨在探討MMPs、TIMPs與氧化應(yīng)激及炎癥因子，包括子宮內(nèi)膜超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在習(xí)慣性流產(chǎn)孕婦和早孕流產(chǎn)孕婦外周血及流產(chǎn)組織中的表達情況，并進一步探究其內(nèi)在的聯(lián)系。

1　資料和方法

1.1一般資料 收集自2012年10月至2014年10月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院及臺州恩澤醫(yī)療中心集團婦產(chǎn)科收治的習(xí)慣性流產(chǎn)孕婦32例作為觀察組，參照全國統(tǒng)編教材《婦產(chǎn)科學(xué)》［6］習(xí)慣性流產(chǎn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除先兆流產(chǎn)，排除有糖尿病、風(fēng)濕、感染、腫瘤等基礎(chǔ)疾病。入選病例在住院期間保胎失敗，年齡22～34歲，平均（28.22±3.52）歲；體質(zhì)量56～68 kg，平均（60.68±6.82）kg；孕周2～14周，平均（5.35±0.77）周；習(xí)慣性流產(chǎn)2～5次，平均（3.21±0.75）次。同時選擇同期溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院及臺州恩澤醫(yī)療中心集團婦產(chǎn)科收治的35例早孕人工流產(chǎn)孕婦作為對照組，年齡21～ 34歲，平均（27.89±2.21）歲；體質(zhì)量55～67 kg，平均（61.08±6.47）kg；孕周3～10周，平均（5.32± 0.69）周。2組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2檢測指標(biāo)和方法 流產(chǎn)后20 min內(nèi)抽取靜脈血10 mL 3 000 r/min離心10 min制備血清，保存于-60 ℃冰箱中待檢，ELISA試劑盒法檢測各組血清中MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1的含量，試劑盒購自武漢博士德生物工程公司，嚴(yán)格按照說明書進行操作。流產(chǎn)后當(dāng)即取子宮內(nèi)膜組織（包含絨毛）2 g，冰浴下洗凈紗布吸干后置于凍存管內(nèi)，于-70 ℃保存待測。臨測時，4 ℃ 0.9%氯化鈉溶液預(yù)冷，超聲細(xì)胞粉碎儀下制成10%濃度組織勻漿，低溫離心機3 000 r/min離心10 min取上清液，ELISA試劑盒法檢測各組上清液中MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1的含量，試劑盒購自武漢博士德生物工程公司，嚴(yán)格按照說明書進行操作；ELISA試劑盒法檢測SOD、GSH-PX、MDA，試劑盒購自南京建成生物公司；ELISA試劑盒法檢測IL-6、TNF-α，試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司，操作嚴(yán)格按照說明書進行。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料進行正態(tài)性檢驗，以±s表示，不同組間比較用獨立樣本t檢驗，相關(guān)性用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組外周血清MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1的含量 與對照組比較，觀察組MMP-2明顯下降（t= -2.216，P＜0.05），MMP-9明顯升高（t=4.205，P＜0.01），TIMP-2明顯升高（t=2.105，P＜0.05），TIMP-1 2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1　各組外周血清MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1比較（±s，μg/L）

表1　各組外周血清MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1比較（±s，μg/L）

與對照組比：aP＜0.05，bP＜0.01

組別　n　MMP-2　MMP-9　TIMP-2　TIMP-1對照組　35　121.17±31.52a　141.41±41.37a　127.61±63.62a　139.28±51.82觀察組　32　101.26±35.56a　184.22±39.79b　148.67±61.66a　142.25±48.98

2.2各組子宮內(nèi)膜組織上清MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1的含量 與對照組比較，觀察組子宮內(nèi)膜組織上清MMP-2、MMP-9明顯下降（分別t=-3.354、-3.676，P＜0.01）；TIMP-2明顯升高（t=2.698，P＜0.05），TIMP-1 2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.3各組子宮內(nèi)膜組織上清氧化應(yīng)激及炎癥指標(biāo)的含量 與對照組比較，觀察組子宮內(nèi)膜組織上清SOD明顯下降（t=-2.149，P＜0.05），MDA、IL-6、TNF-α明顯升高（分別t=2.632、3.174、6.083，P＜0.05或0.01），GSH-PX 2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表2　各組組織上清MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1比較（±s，μg/L）

表2　各組組織上清MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1比較（±s，μg/L）

與對照組比：aP＜0.05，bP＜0.01

組別　n　MMP-2　MMP-9　TIMP-2　TIMP-1對照組　35　152.68±46.21b　221.64±61.82b　125.21±57.87b　147.28±47.68觀察組　32　86.27±35.32b　102.47±43.37b　168.66±69.61a　135.78±55.88

表3　各組組織上清氧化應(yīng)激及炎癥指標(biāo)比較（±s）

表3　各組組織上清氧化應(yīng)激及炎癥指標(biāo)比較（±s）

與對照組比：aP＜0.05，bP＜0.01

組別　n　SOD（U/mgprot）　GSH-PX（U/mgprot）　MDA（nmol/mgprot）　IL-6（pg/L）　TNF-α（pg/L）對照組　35　103.09±12.32a　62.29±10.45　63.71±6.18a　76.21±12.40a　207.54±58.81a觀察組　32　96.30± 8.86a　58.00± 6.88　83.76±4.46a　90.28±16.42b　300.11±43.27b

2.4相關(guān)性分析 對子宮內(nèi)膜組織上清MMPs、TIMPs與氧化應(yīng)激及炎癥指標(biāo)作相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，MMP-2 與SOD、GSH-PX呈正相關(guān)（r=0.376、0.356，P＜0.05），MMP-9與SOD、GSH-PX呈正相關(guān)（r=0.338、0.324，P ＜0.05），TIMP-2與MDA、TNF-α呈正相關(guān)（r=0.368、0.372，P＜0.05）。

3　討論

習(xí)慣性流產(chǎn)是不孕不育研究領(lǐng)域的一大難點，其困擾了許多結(jié)婚不育家庭及臨床醫(yī)務(wù)工作者［7-8］。國外有學(xué)者認(rèn)為其與子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)異常和分子水平的紊亂相關(guān)，Anumba等［3］的研究顯示MMPs/ TIMPs的異常表達和失平衡可能與習(xí)慣性流產(chǎn)的發(fā)生密切相關(guān)，而國內(nèi)有關(guān)此方面的報道較少，我們期望通過以早孕人工流產(chǎn)孕婦作為對照，觀察習(xí)慣性流產(chǎn)孕婦外周血清及子宮內(nèi)膜組織MMPs、TIMPs與氧化應(yīng)激及炎癥指標(biāo)表達的差異，來初步探討其內(nèi)在聯(lián)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，習(xí)慣性流產(chǎn)孕婦與早孕流產(chǎn)孕婦外周血、子宮內(nèi)膜組織MMPs、TIMPs及氧化應(yīng)激、炎癥因子指標(biāo)的表達存在差異，習(xí)慣性流產(chǎn)孕婦外周血清MMP-2明顯下降，MMP-9、TIMP-2明顯升高，這與國外Koucky等［9］對早產(chǎn)的研究結(jié)果相似，其異常表達可能與習(xí)慣性流產(chǎn)的發(fā)生相關(guān)。對子宮內(nèi)膜組織上清中MMPs、TIMPs表達的研究發(fā)現(xiàn)，習(xí)慣性流產(chǎn)孕婦MMP-2、MMP-9明顯下降，TIMP-2明顯升高，這與Anumba等［3］、Konacl等［4］的研究結(jié)果相似，證實了子宮內(nèi)膜MMPs/TIMPs的異常表達與失平衡參與了習(xí)慣性流產(chǎn)的發(fā)生，妊娠成功的關(guān)鍵是胚胎順利植入子宮內(nèi)膜，這個過程主要與滋養(yǎng)細(xì)胞對內(nèi)膜的適度侵襲相關(guān)，尤其是對細(xì)胞外基質(zhì)的降解，滋養(yǎng)細(xì)胞的侵入過程受自分泌和旁分泌的精確調(diào)控，多種細(xì)胞因子參與此過程，其中MMP-2、MMP-9的作用非常重要，MMP-2主要降解蛻膜組織而MMP-9主要降解胎膜明膠，MMPs對細(xì)胞外基質(zhì)的降解是滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲成功的關(guān)鍵，F(xiàn)ontana等［10］的研究證實MMP-2 及MMP-9的活性下降是妊娠失敗的重要原因，此外，自然流產(chǎn)也可能與滋養(yǎng)細(xì)胞的異常生物學(xué)行為相關(guān)，MMPs的低表達導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤能力不足，螺旋小動脈無法轉(zhuǎn)化為低阻力血管，胎盤局部缺血缺氧，最終導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生；對子宮內(nèi)膜組織上清氧化應(yīng)激及炎癥因子指標(biāo)的研究發(fā)現(xiàn)，習(xí)慣性流產(chǎn)孕婦SOD明顯下降，MDA、IL-6、TNF-α明顯升高，這提示了習(xí)慣性流產(chǎn)孕婦子宮局部存在氧化與抗氧化的失衡及炎癥反應(yīng)的異常激活；通過對MMPs、TIMPs與炎癥應(yīng)激指標(biāo)作相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，MMP-2的下降與SOD、GSH-PX呈相關(guān)，MMP-9下降與SOD呈正相關(guān)，TIMP-2的升高與MDA、TNF-α呈正相關(guān)，這提示兩者協(xié)同參與了習(xí)慣性流產(chǎn)的發(fā)生。另外，Wang等［11］的研究發(fā)現(xiàn)，MMP-1抑制劑可阻斷早產(chǎn)的發(fā)生，這為臨床治療習(xí)慣性流產(chǎn)提供了一個新的研究方向，提示可通過調(diào)整MMPs/TIMPs的表達來治療習(xí)慣性流產(chǎn)。

綜上，MMPs/TIMPs系統(tǒng)的異常表達和失平衡及炎癥應(yīng)激的異常激活可能與習(xí)慣性流產(chǎn)的發(fā)生密切相關(guān)。本研究不足之處是樣本量太少，在今后工作中將繼續(xù)積累病例進行觀察研究。

［1］林其德. 免疫所致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和習(xí)慣性流產(chǎn)［J］. 中華婦產(chǎn)科雜志， 2000， 35（12）: 760-762.

［2］崔魴， 孟江萍. 不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)患者外周血Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞表達及其臨床意義［J］. 中國醫(yī)師雜志， 2014，16（1）: 35-41.

［3］Anumba DO， Gelany SE， Elliott SL， et al. Rcesieracrcuh lating levels of matrix proteases andtheir inhibitors in pregnantwomen with and without a history of recurrent pregnancy loss［J］. Reprod Biol Endocrinol， 2010， 8（1）: 62-70.

［4］Konacl E， Alp E， Onen HI， et al. Endometrial mRNA expression of matrix metalloproteinases， their tissue inhibitors and cell adhesion molecules in unexplained infertility and implantation failure patients［J］. Reprod Bio Med Onlin，2009， 19（3）: 391-397.

［5］劉文軍， 梁灼萍， 陳祖堯， 等. 基質(zhì)金屬蛋白酶9和腫瘤壞死因子α表達與大鼠上下呼吸道炎性反應(yīng)一致性研究［J］.中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志， 2011， 46（4）: 325-330.

［6］樂杰. 婦產(chǎn)科學(xué)［M］. 6版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社， 2004: 101-105.

［7］王英俊， 李大文， 張唯力， 等. 主要精液參數(shù)及精子DNA完整率與不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)的相關(guān)性［J］. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志， 2012， 29（5）: 602-605.

［8］張先霞， 王繁. IVF-ET術(shù)后流產(chǎn)患者絨毛和蛻膜組織凋亡及相關(guān)調(diào)控蛋白的表達［J］. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報， 2012， 42（6）: 545-548.

［9］Koucky M， Germanova P， Mikolajczyk M， et al. Low maternal serum matrix metalloproteinase （MMP-2） concentrations are associated with preterm labor and fetal inflammatory response［J］. Perinat Med， 2010， 38（1）: 1-8.

［10］Fontana VA， Sanchez M， Cebral E， et al. Interferon-γinhibits metalloproteninase activity and cytotrophoblast cell migration［J］. Am J Reprod Immunol， 2010， 64（1）: 20-26.

［11］Wang W， Yen HT， Chen CH， et al. Prevention of inflammations associated preterm birth by knockdown of the endothelin-1［J］. Molecul Med， 2010， 10（1）:1-33.

（本文編輯：胡苗苗）

Expression of MMPs， TIMPs and inflammatory factors in habitual abortion cases

MA Danqi1，2， LIANG Dan3， LI Aijin3， YANG Lizhu4， LYU Jieqiang1.
1.Department of Obstetrics and Gynecology， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325027； 2.Family Planning Publicity & Education Technical Advising Center of Luqiao， Taizhou， 318050； 3. Department of Obstetrics and Gynecology， Taizhou Grace Medical Center Group， Taizhou， 318050； 4.School of Pharmaceutical Sciences， Wenzhou Medical University， Wenzhou，325035

Objective: To investigate the expression of MMPs， TIMPs， Oxidative stress and inflammatory factors in serum and endometrial tissue of habitual abortion cases and to evaluate their clinical significance. Methods: From Oct. 2012 to Oct. 2014， 32 habitual abortion pregnant women were recruited as observed group，meanwhile 35 pregnancy abortion women were enrolled as control group. The expression of MMP-2， MMP-9， TIMP-2， TIMP-1 in serum and endometrial tissue were measured by ELISA. The expression of inflammatory factors in endometrial tissue including IL-6， TNF-α， MDA， SOD and GSH-PX were also detected by ELISA. Finally， the correlations of them were analyzed. Results: Compared to control group， the expression of MMP-2 in serum of observed group decreased obviously （P＜0.05）， MMP-9， TIMP-2 increased significantly （P＜0.05）； the expression of MMP-2 and MMP-9 of observed group in endometrial tissue declined obviously （P＜0.01）， while TIMP-2 improved remarkably （P＜0.05）； the expressions of MDA， IL-6， TNF-α of observed group in endometrium tissue were upregulated （P＜0.05）， but SOD was downregulated （P＜0.05）； in endometrial tissue of observed group， there were positive correlation between MMP-2， MMP-9 with SOD， GSH-PX， and between TIMP-2 with MDA， TNF-α. Conclusion: The imbalance of MMPs/TIMPs system and abnormal expression of inflammatory factors may be associated with habitual abortion.

habitual abortion； matrix metalloproteinase； tissue inhibitor of metalloproteinase； inflammatory；oxidative stress

R714.21

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.11.004

2015-03-31

國家自然科學(xué)基金資助項目（31300819）；浙江省自然科學(xué)基金資助項目（LQ12B05004）。

馬丹琦（1987-），女，浙江臺州人，住院醫(yī)師，在職碩士生。

呂杰強，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，Email：jieqianglu@126.com。