hNIS基因轉(zhuǎn)染SW480細胞裸鼠模型的建立及核素顯像

張紅征，杜凡，周佰林，文正偉，李煥斌，王玲，張琦

（1.溫州醫(yī)科大學 核醫(yī)學教研室，浙江 溫州 325035；2.浙江大學附屬邵逸夫醫(yī)院 核醫(yī)學科，浙江杭州 310020；3.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 放射科，浙江 溫州 325015）

hNIS基因轉(zhuǎn)染SW480細胞裸鼠模型的建立及核素顯像

張紅征1，杜凡2，周佰林3，文正偉1，李煥斌1，王玲1，張琦1

（1.溫州醫(yī)科大學 核醫(yī)學教研室，浙江 溫州 325035；2.浙江大學附屬邵逸夫醫(yī)院 核醫(yī)學科，浙江杭州 310020；3.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 放射科，浙江 溫州 325015）

目的：觀察人鈉/碘轉(zhuǎn)運體（hNIS）重組質(zhì)粒（pcDNA3.1+-hNIS）脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細胞（SW480）的裸鼠模型介導放射性核素顯像的可行性。方法：酶切鑒定pcDNA3.1+-hNIS，轉(zhuǎn)染SW480細胞并檢測hNIS基因及蛋白的表達，篩選穩(wěn)定表達hNIS的SW480細胞，建立腫瘤裸鼠模型并進行放射性核素99mTcO4-顯像。

人鈉/碘轉(zhuǎn)運體；131I；結(jié)腸腫瘤；裸鼠

近年來由于生活水平的提高以及飲食結(jié)構(gòu)的變化，導致結(jié)腸癌（colorectal cancer，CRC）發(fā)病率持續(xù)上升。全世界男性患者惡性腫瘤中CRC發(fā)病率居第三，女性居第二［1］。CRC起病隱匿，早期通常沒有明顯的臨床表現(xiàn)，癥狀明顯時大多已處于中晚期，其生物學特性復雜且惡性程度高，化療的多重耐藥性令其預后不理想，進展期結(jié)腸癌的治療一直都不理想。因此CRC的早期診斷以及早期治療尤為重要。

hNIS作為一種腫瘤報告以及治療基因，通過載體介導的hNIS基因轉(zhuǎn)染低分化甲狀腺癌或非甲狀腺癌細胞，在顯像及放射性131I治療研究中都取得了良好的效果［2］。對于CRC的放射性核素顯像和治療研究尚不多見，因而我們設想結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)與放射性核素顯像技術(shù)，將hNIS基因轉(zhuǎn)染至SW480細胞中，使原本不攝碘的SW480細胞獲得攝碘能力，然后利用核素顯像，達到早期檢測腫瘤的目的，進而為放射性131I治療打好基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料 SW480細胞購于上海中科院細胞庫；空白質(zhì)粒pcDNA3.1+以及pcDNA3.1+-hNIS由核醫(yī)學實驗室提供；99mTcO4-購于中國原子高科有限公司；裸鼠BALB/C-nu/nu品系（SPF級）由上海實驗動物研究中心提供；hNIS蛋白一抗購于Abcam公司；內(nèi)參一抗以及相關(guān)二抗購于Cell Signaling公司；RT-PCR及Western blot相關(guān)試劑盒購于碧云天生物公司。

1.2方法

1.2.1pcDNA3.1+-hNIS及pcDNA3.1+行BamH I/EcoR I酶切鑒定：按照酶切步驟配置反應體系，37 ℃反應2 h，取2 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳。反應體系見表1。

表1　酶切反應體系

1.2.2pcDNA3.1+-hNIS脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染SW480細胞并篩選穩(wěn)定表達細胞：1640培養(yǎng)基、37 ℃、5% CO2、雙抗0.5 mL，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)SW480細胞，將細胞調(diào)節(jié)濃度至1.5×107/mL；接種至6孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后觀察到細胞80%～90%融合狀態(tài)時換1640無血清培養(yǎng)基同步化24 h。將細胞分為轉(zhuǎn)染組、空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空白對照組，按照脂質(zhì)體法操作步驟進行轉(zhuǎn)染并于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；6 h后換有血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，之后G418篩選轉(zhuǎn)染細胞，得到穩(wěn)定表達hNIS基因的單克隆SW480細胞系。

1.2.3RT-PCR及Western blot檢測轉(zhuǎn)染細胞hNIS mRNA及蛋白的表達：按照試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計測定細胞總RNA在260 nm和280 nm處的光密度值并計算RNA的含量和純度。然后對總RNA進行RT，然后PCR。hNIS上游引物序列：gactgatgtgttcc aggtcgt，下游引物序列：gggtcgcagtcagtgtagaac；β-actin上游引物序列：ccttcctgggcatggagtcct，下游引物序列：ggagcaatgatcttgatctt。完成后每孔加5 μL的目的和內(nèi)參DNA行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。計算相同體積、濃度的上樣提取液，100 ℃ 10 min變性后于10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）上進行電泳分離，300 mA濕轉(zhuǎn)70 min將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。PVDF膜置與5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h。5%脫脂牛奶1∶500比例稀釋hNIS一抗，4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，5%脫脂牛奶1∶1 000比例稀釋hNIS二抗，室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入ECL反應液，與暗室中X線底片曝光，以β-actin為內(nèi)參，按照上述方法操作。

1.2.4裸鼠移植瘤模型的建立：5～6周裸鼠在恒溫（25～27 ℃）、恒濕（25%～50%）和SPF條件下適應性喂養(yǎng)7 d，在觀察到裸鼠精神、飲食以及排便等狀況良好的情況下，隨機分成轉(zhuǎn)染組、空白質(zhì)粒對照組、空白對照組3組，每組10只。以75%酒精消毒裸鼠肩胛骨處皮膚，各組在同一部位用注射器抽取0.2 mL相應單細胞懸浮液注射于皮下。接種腫瘤細胞后，每日觀察裸鼠精神、飲食及排便等一般狀況，每3 d稱量體質(zhì)量1次。成瘤后觀察移植瘤生長情況，注意腫瘤表面有無紅腫、破潰等。SW480細胞接種同時按照5 mg/L加優(yōu)甲樂至裸鼠飲水中封閉甲狀腺直至實驗結(jié)束，減少甲狀腺攝取量并增加移植瘤攝取量。

1.2.5hNIS轉(zhuǎn)染SW480細胞后介導的腫瘤核素顯像：3組裸鼠腫瘤接種4周測得皮下瘤塊直徑達到15 mm左右時，分別取3組成瘤裸鼠，并固定于泡沫板上，俯臥位，每只裸鼠腹腔注射溶于0.l mL 0.9%氯化鈉溶液的300 μCi99mTcO4-，注射10 min后用SPECT顯像，采用低能高分辨準直器，采集總計數(shù)500 K。

2　結(jié)果

圖1　重組質(zhì)粒pcDNA3.1+-hNIS BamH I/EcoR I酶切凝膠電泳

2.1pcDNA3.1+-hNIS及pcDNA3.1+BamH I/EcoR I酶切凝膠電泳結(jié)果 以Beyotime DNA Ladder為核酸分子量標準，重組質(zhì)粒組結(jié)果顯示在7 000 bp左右有1條清晰條帶，在2 000 bp和5 500 bp左右有2條清晰的條帶，與理論計算結(jié)果相符合。見圖1。2.2 G418篩選轉(zhuǎn)染hNIS-SW480細胞結(jié)果 未做任何處理的野生SW480在經(jīng)過0～1 000 μg/mL不同濃度培養(yǎng)2周后，得出最高能夠存活的G418濃度為200 μg/mL，見圖2。取高一個濃度為篩選濃度即300 μg/mL，培養(yǎng)經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒和空白質(zhì)粒的SW480細胞，可得表達hNIS基因的細胞系（hNIS-SW480）。通過有限稀釋法挑出單克隆，之后維持G418濃度為篩選濃度的一半即150 μg/mL培養(yǎng)，即為穩(wěn)定表達hNIS基因的SW480細胞系，見圖3。

圖3　有限稀釋法得到的穩(wěn)定表達hNIS基因的SW480細胞系（×100）

2.3pcDNA3.1+-hNIS轉(zhuǎn)染SW480細胞hNIS RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳 RT-PCR后行1.5%瓊脂糖凝膠電泳轉(zhuǎn)染組可見擴增的369 bp大小條帶，而空白質(zhì)粒對照組及空白對照組未檢測到hNIS mRNA的表達，見圖4。SW480細胞轉(zhuǎn)染后Western blot電泳顯示在轉(zhuǎn)染組可見69 kd大小條帶，而空白質(zhì)粒對照組及空白對照組未檢測到hNIS蛋白的表達，見圖5。

圖4　重組質(zhì)粒pcDNA3.1+-hNIS轉(zhuǎn)染SW480細胞hNIS RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.4hNIS轉(zhuǎn)染SW480細胞系后介導的腫瘤99mTc04-核素顯像 荷瘤裸鼠甲狀腺封閉2周后，腹腔內(nèi)注射300 μCi99mTc04-顯像劑，10 min后應用SPECT顯像，可見轉(zhuǎn)染組移植瘤明顯顯影，而空白質(zhì)粒對照組及空白對照組移植瘤未顯影，見圖6。

圖5　重組質(zhì)粒pcDNA3.1+-hNIS轉(zhuǎn)染SW480細胞hNIS Western blot凝膠電泳結(jié)果

圖6　種植腫瘤后裸鼠模型99mTc04-顯像結(jié)果

3　討論

CRC是人類常見惡性腫瘤之一，其發(fā)生與很多因素都有關(guān)，比如遺傳、飲食習慣等［3］。CRC的發(fā)生是多個基因如原癌基因和抑癌基因協(xié)同作用的結(jié)果。CRC早期沒有特異性癥狀，發(fā)現(xiàn)時已多屬于晚期，手術(shù)治療以及多種化療藥物的耐藥性和嚴重的不良反應降低了療效，近年來病死率居高不下。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)逐步發(fā)展，基因替換或修復、基因增補、基因失活、免疫調(diào)節(jié)等逐漸應用于腫瘤的治療。hNIS作為一種報告基因和腫瘤治療基因，借助于hNIS的靶向特異性，可為CRC的診療開辟新途徑。

hNIS主要功能是將細胞外碘離子逆濃度梯度轉(zhuǎn)運入甲狀腺細胞中，是甲狀腺激素生物合成、核素顯像及放射性碘治療的基礎(chǔ)。如今，hNIS被廣泛應用到基因診療的研究中，Smit等［4］將hNIS基因轉(zhuǎn)染入帶有hNIS缺陷的濾泡性甲狀腺癌細胞系FTC 133中，增強了其對131I的攝取能力。在SPECT顯像過程中，作為報告基因?qū)δ[瘤進行定位［5］；同時作為一種腫瘤治療基因，在放射性治療研究中，通過載體介導的NIS基因轉(zhuǎn)染非甲狀腺癌細胞，然后采取131I治療，并都取得了可喜的進展，如前列腺癌、肝癌以及乳腺癌［6-8］。本實驗中pcDNA3.1+-hNIS BamH I/ EcoR I雙酶切凝膠電泳結(jié)果符合理論計算結(jié)果。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法［9］成功將鑒定好的hNIS重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SW480細胞中，轉(zhuǎn)染后檢測到hNIS mRNA以及蛋白的表達，而空白質(zhì)粒對照組及空白對照組均未檢測到hNIS mRNA以及蛋白的表達。建立裸鼠模型后應用SPECT進行99mTcO4-全身顯像，可得到轉(zhuǎn)染組移植瘤處高攝取影像，而空白質(zhì)粒對照組及空白對照組腫瘤處均未見攝取濃聚灶，說明移植瘤表達hNIS蛋白并且具有功能，這為結(jié)腸癌的早期診斷提供了一種新的影像學檢查方法［10］。Scholz等［11］將hNIS轉(zhuǎn)染到結(jié)腸癌HCT 116細胞中行放射性碘治療取得良好的效果，杜凡等［12］實驗結(jié)果得出131I對轉(zhuǎn)染hNIS 的SW480細胞具有顯著殺傷效果，這也為我們進一步進行131I顯像以及體內(nèi)放射性碘治療提供了實驗依據(jù)。

盡管hNIS的研究已經(jīng)取得顯著成果，但如何進一步增強hNIS的表達、調(diào)節(jié)hNIS胞膜靶向定位、提高hNIS重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腫瘤細胞的效率、體內(nèi)轉(zhuǎn)染以及放射性核素治療效果等方面，還需要更深入的研究。

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［3］Terzi? J， Grivennikov S， Karin E， et al. Inflammation and Colon Cancer［J］. Gastroenterology， 2010， 138（6）: 2101-2114.

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［12］杜凡， 周佰林， 張紅征， 等. 人鈉/碘轉(zhuǎn)運體基因轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細胞介導放射性碘治療的實驗研究［J］. 溫州醫(yī)科大學學報， 2014， 44（5）: 334-337.

（本文編輯：吳健敏）

The construction of SW480 cells nude model transfected by hNIS gene and radionuclide imaging

ZHANG Hongzheng1， DU Fan2， ZHOU Bailin3， WEN Zhengwei1， LI Huanbin1， WANG Ling1， ZHANG Qi1. 1.Department of Nuclear Medical， Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325035； 2.Depaertment of Nuclear Medical，SIR RUN RUN SHAW Hospital， Zhejiang University， Hangzhou， 310020； 3.Radiological Department， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325015

Objective: To examine the feasibity of radionuclide imaging mediated by colon cancer cells （SW480） nude model transfected with a recombinant pcDNA3.1+-hNIS plasmid. Methods: pcDNA3.1+-hNIS was confirmed by restriction enzyme digestion， the hNIS gene and protein expression were detected after transfection， the SW480 cells of stably expressing hNIS were screened， the tumors nude mice model was established，then radioactive nuclide99mTcO4-imaging was obtained. Results: After SW480 cells was transfected with pcDNA3.1+-hNIS， the hNIS gene and prote in expression were successfully detected. Radionuclide imaging was successfully mediated by colon cancer cells nude model. Conclusion: The hNIS expression can be achieved in colon nude model by the recombinant plasmid pcDNA3.1+-hNIS， and make the radionuclide imaging and radionuclide therapy of colon cancer as possible.

human sodium/iodide symporter；131I； colonic neoplasms； nude mice

R817-3

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.11.006

2015-03-26

張紅征（1984-），男，山東濰坊人，助教，碩士。

張琦，教授，碩士生導師，Email：wzzhangqi@126. com。

結(jié)果：pcDNA3.1+-hNIS轉(zhuǎn)染SW480細胞后成功檢測到hNIS基因及蛋白的表達，結(jié)腸癌裸鼠模型成功介導放射性核素99mTcO4-顯像。結(jié)論：重組質(zhì)粒pcDNA3.1+-hNIS可以實現(xiàn)結(jié)腸癌裸鼠模型的hNIS表達，使放射性核素顯像和結(jié)腸癌放射性核素治療成為可能。