HoxB8對結直腸癌細胞生長遷移的影響

林飛燕，吳愛華，張培麗，蔣磊，李紹堂

（溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325015，1.內科實驗室；2.普外科）

HoxB8對結直腸癌細胞生長遷移的影響

林飛燕1，吳愛華1，張培麗1，蔣磊1，李紹堂2

（溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325015，1.內科實驗室；2.普外科）

目的：通過構建過表達HoxB8基因的慢病毒表達載體，研究HoxB8基因對結直腸癌細胞生長遷移的影響。方法：采用PCR技術擴增出人HoxB8基因全長，通過限制性內切酶EcoR I和SAC I I雙酶切，T4 DNA連接酶連接，克隆至慢病毒載體，構建Lenti-HoxB8-GFP重組載體。重組陽性克隆進行PCR和酶切鑒定，測序驗證序列正確。將重組載體質粒以及3個輔助質粒共轉染人腎上皮細胞（293T）進行慢病毒包裝，收集病毒顆粒。然后將病毒顆粒感染結直腸癌細胞RKO，并將RKO細胞分為轉染組（轉染慢病毒重組質粒Lenti-HoxB8-GFP）、對照組（轉染空白質粒Lenti-GFP）和空白對照組。RT-PCR和Western blot法檢測病毒感染后HoxB8在細胞中的表達情況。MTT、平板克隆形成實驗和Transwell小孔試驗檢測過表達HoxB8基因對結直腸癌細胞生長遷移的影響。結果：經鑒定顯示重組載體質粒構建成功，測序正確。293T細胞高效包裝Lenti-HoxB8-GFP慢病毒，攜帶HoxB8基因的慢病毒感染RKO細胞后可看到大量綠色熒光，RT-PCR和Western blot法檢測分別證實HoxB8基因和蛋白在轉染組細胞中呈高表達。實驗組細胞的增殖和平板克隆形成能力高于空白組及對照組。Transwell小孔試驗結果顯示HoxB8高表達能夠促進結直腸癌細胞的轉移。結論：成功構建HoxB8慢病毒表達載體，過表達HoxB8能夠促進結直腸癌細胞的增殖、克隆形成以及遷移。

HoxB8；慢病毒載體；結直腸腫瘤；實時熒光定量PCR；蛋白質印記法

Hox（Homeobox）基因是一種發育相關基因，其編碼的蛋白在胚胎發育過程中起到轉錄因子調節作用。最早發現其在黑腹果蠅的胚胎發育中發揮著重要作用。HoxB8是Hox基因家族成員之一，位于17號染色體上［1］。近期的研究［2-3］發現HoxB8在結直腸癌細胞中異常表達，并且與結直腸癌的發生發展以及化療效果相關。本研究通過構建HoxB8慢病毒表達載體，建立HoxB8過表達細胞模型，并研究其對結直腸癌細胞生長轉移的影響。旨在探討HoxB8的表達與結直腸癌發生、發展的關系，為進一步研究HoxB8對結直腸癌的靶向治療及調控機制奠定基礎。

1　材料和方法

1.1主要材料和試劑 慢病毒表達載體Lenti-GFP以及3個輔助質粒pMD2.G、pMDL-G/P-RRE和pRSVREV為本實驗室保存。Taq DNA高保真聚合酶、限制性內切酶EcoR I、SAC I I、T4 DNA連接酶均購自NEB公司；DNA凝膠回收試劑盒、DNA補平試劑盒和質粒提取試劑盒均購自愛思進公司。HoxB8抗體購自abcam；TRIzol、cDNA反轉錄試劑盒和SYBGreen熒光定量PCR試劑購自Invitrogen公司。化學發光底物Thermo Scientific Super-Signal West Femto購自Thermo Fisher，人胚胎腎上皮細胞293T和人結直腸癌細胞RKO購自上海中科院細胞庫。

1.2方法

1.2.1慢病毒表達載體的構建與鑒定：用TRIzol法提取RKO細胞總RNA，酶標儀上測定260 nm/280 nm吸光度值A，計算RNA濃度，選取A260/A280比值介于1.8～2.1之間者用于反轉錄獲得cDNA。然后進行PCR擴增，引物為：HoxB8-F-EcoR I 5’-CGA ATT CGC CAC CAT GAG CTC TTA TTT CG TCA AC-3’；HoxB-RSAC I I 5’-CCG CGG CTA CTT CTT GTC GCC CTT CTG-3’。反應條件：95 ℃ 5 min（95 ℃ 30 s、55 ℃30 s、72 ℃ 1 min）30個循環，72 ℃ 5 min。PCR產物進行純化回收后，與慢病毒載體分別進行EcoR I/SAC I I雙酶切；酶切片段回收、連接后轉化大腸桿菌。選取單個菌落進行PCR鑒定。PCR陽性克隆提取質粒雙酶切鑒定，并測序。測序結果與GeneBank數據庫進行Blast比對。

1.2.2慢病毒包裝：空載體Lenti-GFP、重組質粒Lenti-HoxB8-GFP、包裝質粒pMD2.G、pMDL-G/P-RRE 和pRSV-REV分別用去內毒素大量質粒抽提，測定濃度。用OptiMEM和PEI（1 μg/μL）包裝慢病毒四質粒系統共轉染293T細胞，質粒的用量：pMD2.G 3.5 μg/ 10 cm、pMDL-G/P-RRE 6.5 μg/10 cm、pRSVPREV 3.5 μg/10 cm和Transfer Vector 12 μg/10 cm。48 h后熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光蛋白表達情況，收集上清，25 000 r/min超速離心2 h后用PBS溶解濃縮病毒。逐孔稀釋滴度測定法和Real-timePCR法測定病毒滴度（TU/mL）。

1.2.3慢病毒感染RKO細胞：將Lenti-HoxB8-GFP和空載體Lenti-GFP慢病毒以MOI值為5分別感染RKO細胞，感染12 h后換不含病毒的完全培養基，48 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達。

1.2.4Real-time PCR檢測RKO細胞中HoxB8的表達：將在顯微鏡下能夠觀察到穩定綠色熒光蛋白的RKOGFP（感染Lenti-GFP的RKO細胞）、RKO-HoxB8（感染Lenti-HoxB8-GFP的RKO細胞）以及RKO細胞進行傳代培養，1周后分別收集細胞，加入TRIzol提取總RNA，然后反轉錄獲得cDNA。用SYBGreen染料，在ABI-7500熒光定量PCR儀上進行定量PCR檢測。引物序列為HoxB8-F：5’-TAA GCG GCG AAT CGA GGT AT-3’；HOXB8-R：5’-TGT TTC TCC AGC TCC TCC TG-3’。

1.2.5Western blot法檢測RKO細胞中HoxB8的表達：收集能夠穩定表達綠色熒光蛋白的RKO-GFP、RKO-HoxB8以及RKO細胞，加入裂解液抽提蛋白。參照BCA蛋白濃度檢測試劑盒進行蛋白定量。每個樣品取20 μg進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移。5%脫脂牛奶封閉1.5 h后一抗（HoxB8抗體和內參GAPDH抗體）4 ℃過夜孵育，次日用TBST（含0.1% Tween）洗膜后用二抗室溫雜交1 h，再次洗膜，ECL顯色，最后在凝膠成像系統上成像。

1.2.6MTT法檢測HoxB8對結直腸癌細胞生長的影響：胰蛋白酶消化細胞，血清終止，PBS洗一遍，計數。按3 000個/孔接種于96孔板中，用MTT法分別檢測接種后第1、第2、第3、第4和第5天的細胞生長狀況。

1.2.7平板細胞克隆形成試驗：用胰蛋白酶消化細胞，血清終止后重懸并計數，按照每孔1 000個細胞的密度接種于六孔板中，37 ℃、5% CO2培養，2周后用結晶紫染色，觀察細胞集落數量和大小的變化。

1.2.8Transwell小孔試驗：用胰蛋白酶消化細胞血清終止后1×PBS清洗2遍，無血清的培養基重懸，計數，按每孔5×105個細胞接種在小室內，小室下方加800 μL完全培養基。37 ℃、5% CO2培養，24 h后，用4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，觀察細胞的穿透情況。

1.3統計學處理方法 采用SPSS17.0統計軟件進行統計學處理。各組實驗數據以±s表示，HoxB8 mRNA表達的差異比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1重組表達載體的鑒定 以RKO細胞中HoxB8基因全長為模板擴增HoxB8序列，用1.5%的瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳，在740 bp左右可見特異條帶（見圖1A）。將HoxB8的PCR產物純化后進行EcoRI/SACI I雙酶切，同時慢病毒載體也進行酶切，酶切后電泳鑒定（見圖1B），用T4 DNA連接酶連接，之后進行轉化，挑取單個菌落，進行小量搖菌后做酶切鑒定（見圖1C-D）。酶切產物經測序正確，重組載體Lenti-HoxB8-GFP構建成功。經檢測病毒滴度約108TU/mL。

圖1　重組表達載體的鑒定

2.2慢病毒感染RKO細胞后HoxB8的表達

2.2.1慢病毒感染后熒光蛋白的表達：慢病毒感染結直腸癌細胞，用終濃度8 μg/mL的polybrene增強感染效果，72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，其綠色熒光蛋白表達量達到90%以上（見圖2）。

圖2　Lenti-GFP和Lenti-HoxB8-GFP感染后發綠色熒光的RKO細胞（×100）

2.2.2Real-time PCR和Western Blot法檢測HoxB8 mRNA及蛋白的表達：Real-time PCR結果顯示HoxB8過表達組細胞中HoxB8 mRNA表達量明顯增高（見圖3A）。說明Lenti-HoxB8-GFP慢病毒感染RKO細胞后能夠穩定表達HoxB8 mRNA。Western Blot法實驗結果顯示HoxB8過表達組細胞其HoxB8蛋白的表達量增加（見圖3B），說明包裝產生的Lenti-HoxB8-GFP慢病毒感染RKO細胞后能夠穩定表達HoxB8蛋白。

2.3HoxB8過表達對結直腸癌細胞株RKO生長的影響 結果見圖4。在細胞克隆形成試驗中，HoxB8過表達組細胞的克隆數明顯多于其他2組，說明HoxB8能夠增強結直腸癌細胞的增殖能力（見圖4A、C）。MTT試驗結果顯示，HoxB8過表達組細胞其生長速率高于空白對照組（RKO細胞）和陰性對照組（轉入空載體Lenti-GFP的RKO細胞）（見圖4B）。

2.4HoxB8過表達對結直腸癌細胞株RKO遷移的影響 RKO、RKO陰性對照和RKO轉染組細胞同時進行Transwell試驗，結果顯示HoxB8過表達組有較多細胞穿透Tranwell小室，說明HoxB8過表達能夠增強結直腸癌細胞的遷移能力（見圖5）。

3　討論

在人類基因組中存在39個Hox基因，分布在7p15、17p21、12q13和2q31等4條染色體上［4］。研究發現Hox基因與多種腫瘤的發展相關，例如結直腸癌、胸腺癌、前列腺癌、肺癌、惡性膠質瘤、甲狀腺瘤、卵巢癌、膀胱癌、腎癌以及黑色素瘤等［5-7］。與胸腺癌（來自外胚層）相比，一些具有相似胚胎起源的腫瘤組織（來自內胚層）例如結直腸癌、前列腺癌以及肺癌，表現出相似的HoxA和HoxB家族基因表達模式［8］。不同的Hox基因在組織中的不同位置差異性表達，例如與正常組織相比大腸癌左側有10種Hox基因的異常表達［5］。有研究表明Hox基因在腫瘤組織中異常表達，例如一些研究中發現融合蛋白介導的某些Hox基因的過表達能夠促進腫瘤細胞增殖［9］。此外HoxA9、HoxB8以及HoxB9在腫瘤中呈高表達，而HoxB2、HoxB13以及HoxD8等在腫瘤中呈低表達［5］。Vider等［3］通過細胞水平研究表明HoxB8在結直腸癌細胞中表達上調。并且這種現象在結直腸癌發展的各個時期（包括癌變前期息肉）都有出現［10］。

Hox蛋白是胚胎發育過程中的重要轉錄因子，且其家族中的不同組成部分在成熟組織中呈差異性表達。有研究表明在結直腸癌細胞系如CaCo-2和HT29中，HoxB6、HoxB8、HoxC8以及HoxC9表達上調，并且這種現象在結直腸癌發生發展的各個階段都有出現［3］。Liao等［11］通過體內體外研究表明HoxB7過表達與癌細胞增殖及結直腸癌形成有關。Hur等［12］研究發現在乳腺癌中HoxA6、HoxA13、HoxB2、HoxB4、HoxB5、HoxB6、HoxB7、HoxB8、HoxB9、HoxC5、HoxC9、HoxC13、HoxD1以及HoxD8出現異常表達。在乳腺癌的研究中發現與癌旁組織相比癌組織中有些Hox基因（例如HoxA1、HoxA2、HoxA3、HoxA5、HoxA9、HoxC11、HoxD3、HoxD4、HoxD8、HoxD9以及HoxD10）表達下調［13］，并且在乳腺癌細胞中HoxA5能夠誘導細胞凋亡［14］。此外Shaoqiang等［15］還發現HoxD3高表達的乳腺癌患者，其生存率明顯低于HoxD3低表達的患者，證明HoxD3與不良預后有關。前列腺癌細胞中HoxC8過表達能夠影響細胞的分化潛能，在腫瘤的遷移侵襲過程中發揮著一定的作用［16］。另有研究發現HoxA9、HoxA13、HoxB13、HoxD13以及HoxC11在前列腺的發育過程中起到重要作用，但是HoxA9、HoxB13、HoxC4、HoxC5和HoxC8在前列腺癌的形成過程中異常表達［17］。

圖3　HoxB8 mRNA及蛋白表達的檢測

圖4　HoxB8對RKO細胞增殖能力的影響

圖5　HoxB8對RKO細胞遷移能力的影響

Hox基因家族成員之一HoxB8位于17號染色體上［1］。Vider等［3］研究表明HoxB8在結直腸癌細胞中表達下調，其結果顯示HoxB8可能與結直腸癌的發生相關。此外在小鼠胚胎中發現miRNA-196a介導HoxB8 mRNA的分解，并且體外研究發現HoxB8表達下調與miRNA-196a有關，此研究結果顯示在脊椎動物胚胎發育中miRNA-196a介導調控HoxB8基因的表達［18］。另外Schimanski等［19］研究發現miRNA-196a的表達量增加能夠促進癌細胞分離、轉移、侵襲以及提高其對platin衍生物的化學敏感性，但是對癌細胞的增殖和凋亡影響不大。因此，miRNA-196a可能通過調控HoxB8基因表達影響癌細胞的擴散、轉移以及侵襲。Sugimachi等［20］研究發現在肝癌中HoxB8是miRNA-718的潛在靶點，并且其表達上調與不良預后有關。提示HoxB8基因可能作為結直腸癌的治療靶點。

本研究成功構建Lenti-HoxB8-GFP慢病毒表達載體，通過病毒包裝后獲得高滴度的慢病毒顆粒。用此病毒感染RKO細胞后，可在熒光顯微鏡下觀察到大量綠色熒光，同時Real-time PCR及Western blot法檢測到HoxB8 mRNA和蛋白的高表達。MTT和細胞克隆形成試驗顯示HoxB8基因過表達能夠促進結直腸癌細胞的增殖和克隆形成能力，同時HoxB8能夠增強結直腸癌細胞的遷移能力。陳玉燕等［21］研究發現NF-κB和MMP-9的高表達與結直腸癌的淋巴結轉移高度相關，因此在結直腸癌發生發展過程中這三者之間可能存在著某種聯系。黃立勇等［22］研究發現miRNA-196和HoxB8的表達差異可能與結直腸癌患者對Folfox4方案的化療敏感性相關，HoxB8的表達水平可能通過受到miRNA-196的調控從而影響Folfox4化療敏感性。Li等［23］經研究預測HoxB8可能作為預測FOLFOX4對結直腸癌患者治療效果的標志物。同樣在Lu等［2］的研究中，也發現以HoxB8等7個基因為基礎建立的基因預測模型在預測FOLFOX4對肝轉移結直腸癌患者的化學治療敏感性具有較高的精確度。而胡萬樂等［24］研究發現3-甲基腺嘌呤能夠影響人耐藥大腸癌SW480細胞的增殖和自噬活動，并且與5-FU聯用能夠提高化療效果。因此或許通過調控HoxB8基因的表達，影響結直腸癌對化療藥物的敏感性，降低藥物有效治療濃度會是一個新的突破口。HoxB8可能可以作為結直腸癌新的治療靶點。本研究成功構建了HoxB8慢病毒顆粒以及HoxB8過表達細胞模型，并初步證明HoxB8基因對結直腸癌生長轉移的影響，為進一步研究HoxB8基因在結直腸癌中的生物學功能、分子機制及尋找新的治療靶點奠定了基礎。

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（本文編輯：胡苗苗）

Effect of HoxB8 gene on colon cancer cells growth and migration

LIN Feiyan1， WU Aihua1， ZHANG Peili1，JIANG Lei1， LI Shaotang2.
1.Laboratory of Internal Medicine， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325015； 2.Department of General Surgery， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325015

Objective: To construct a lentiviral vector Lenti-HoxB8-GFP that containing human HoxB8 gene and investigate its role in colon cancer cells. Methods: The HoxB8 gene was amplified and cloned into a lentiviral vector by restriction endonuclease EcoR I/SAC II digestion and T4 DNA ligase ligation to form recombinant Lenti-HoxB8-GFP. The positive clones were identified by PCR and sequencing， after transformation into E. coli cells. Lentivirus were produced by co-transfection of lentiviral vector and the three packaging vector into 293T cells. The RKO cells were transduced with Lenti-HoxB8-GFP and the expression of HoxB8 was detected by Real-time PCR and western blotting Cell proliferation and colony forming ability were detected by MTT and plate clone assay. Cell migration was measured by Transwell assay. Results: The lentiviral vector Lenti-HoxB8-GFP containing HoxB8 gene was successfully constructed. Most of the cells had strong green fluorescence after transfected with the collected virus for 72 h. Real-time PCR and western blotting verified the overexpression of HoxB8 in the transfected RKO cells. Overexpression of HoxB8 promoted RKO cell proliferation and cell colony formation. Moreover， overexpression of HoxB8 increased colorectal cancer cell migration. Conclusion: HoxB8 gene promoted proliferation， cell colony formation and cell migration in colorectal cancer RKO cells.

HoxB8； lentiviral vector； colorectal neoplasms； Real-time PCR； Western blot

R733

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.11.002

2015-04-03

浙江省教育廳科研基金資助項目（Y201326738）；浙江省醫藥衛生科技計劃項目（2013KYA129）；溫州市科技計劃項目（Y20140667）；浙江省自然科學基金資助項目（LY15H160057）。

林飛燕（1987-），女，浙江溫州人，助理實驗員。

李紹堂，副主任醫師，Email：lishaotang163@163. com。