耐百草枯人肺腺癌細胞株的建立及其生物學特性

洪廣亮，譚佳平，丁穎威，趙光舉，李萌芳，盧中秋

（溫州醫科大學附屬第一醫院 急診科，浙江 溫州 325015）

·論 著·

耐百草枯人肺腺癌細胞株的建立及其生物學特性

洪廣亮，譚佳平，丁穎威，趙光舉，李萌芳，盧中秋

（溫州醫科大學附屬第一醫院 急診科，浙江 溫州 325015）

目的：建立耐百草枯（PQ）的人肺腺癌細胞株（A549/PQ），并初步研究其生物學特性。方法：采用濃度遞增誘導法建立A549/PQ，光鏡觀察細胞形態變化，以乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性檢測法、CCK-8法檢測A549/PQ和親本A549對PQ的敏感性，計算A549/PQ的半數抑制濃度（IC50）和耐藥指數（RI），細胞計數法繪制細胞生長曲線和倍增時間，流式細胞技術分析細胞周期。結果：光鏡下A549/PQ細胞變大、形態不規則、細胞間隙變大。PQ誘導A549/PQ細胞LDH釋放明顯低于其親本細胞，差異有統計學意義（P＜0.05）。PQ誘導A549/PQ細胞IC50為1716.33 μmol/L明顯高于A549細胞的215.03 μmol/L（P＜0.05），RI為7.98。A549/PQ細胞倍增時間明顯高于A549細胞，差異有統計學意義（P＜0.05）。A549/PQ細胞G0/G1期細胞明顯增多，S期細胞明顯減少（P＜0.05）。結論：成功構建對PQ耐藥的A549細胞，其生物學特征與親本細胞存在明顯差異，為PQ毒理機制研究提供了良好細胞模型。

百草枯；耐藥株；生物學特性

百草枯（Paraquat，PQ），化學名1-1-二甲基-4-4-聯吡啶陽離子鹽，是一種快速滅生性除草劑，在全球范圍內廣泛應用。其對人畜有很強毒性，缺乏特效解毒劑，急性中毒病死率高達40%～80%［1］。PQ毒性可累及人體多個臟器，如肺、肝、腎、中樞神經系統等，其中肺是PQ中毒損害的最主要靶器官［2］。PQ在肺組織內特異性蓄積是造成肺臟持續損害的關鍵，其機制迄今尚未闡明［3］。近年，有學者［4-5］通過分析耐PQ的突變植株，發現了PQ在植物體內轉運蓄積的重要機制，這為我們研究PQ在哺乳動物細胞跨膜轉運機制提供了新思路。本研究通過濃度遞增持續誘導篩選獲得耐PQ的人肺腺癌細胞株（A549/ PQ），旨在為PQ中毒毒理及其跨膜轉運機制研究、探索逆轉PQ毒性途徑提供細胞模型。

1　材料和方法

1.1材料 人肺腺癌細胞（A549）由上海東方肝膽外科醫院病毒與基因治療實驗室保存，PQ購自美國Sigma公司，胎牛血清、1640培養基購自美國Gibco公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所，LDH試劑盒、細胞周期與凋亡試劑盒均由上海碧云天生物技術有限公司提供。細胞培養箱（美國Thermo），Countstar細胞計數儀（上海艾力特公司），ELx800酶標儀（美國BioTek），倒置顯微鏡（Leica公司），照相機（日本Nikon），流式細胞儀（美國BD）。

1.2細胞培養和A549/PQ建立 A549細胞置于含10%胎牛血清的1640培養基中常規培養，條件為37 ℃，5% CO2。每次取對數生長期的細胞用于實驗。

采用逐步提高培養基中PQ濃度的方法來誘導細胞耐藥，PQ在培養基中的濃度首先從100 μmol/L開始，加藥24 h后換液去除藥物，待細胞重新生長至對數期后再次加相同濃度PQ刺激，如此重復3次后，延長暴露時間至48 h，重復上述過程，再增加PQ濃度。所用PQ濃度依次為100、200、400、600、800 μmol/L，連續培養11個月，得到A549耐PQ細胞株，命名為A549/PQ。

1.3細胞形態觀察 取對數生長期的A549和A549/ PQ細胞，常規消化傳代后，使用Leica光學顯微鏡在24 h細胞完全貼壁后觀察細胞形態，并用Nikon照相機拍照。

1.4細胞計數法繪制細胞生長曲線和測定倍增時間 取5×104個處于對數生長期、狀況良好的親本A549細胞和A549/PQ細胞，制成細胞懸液，分別接種到培養瓶中，每種細胞接種21瓶。24 h后開始細胞計數，連續計數7 d，每天計數3瓶細胞，根據計數結果，繪制細胞生長曲線。再根據公式計算倍增時間（DT），DT=t×lg2/（lgNt-lgN0），t為細胞培養時間，N0為接種24 h后測得的細胞數量平均值，Nt為培養t小時后的細胞數量平均值。

1.5乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性檢測法檢測細胞對PQ的敏感性 將對數生長期、生長狀況良好的A549細胞和A549/PQ細胞，接種到96孔板中，使待檢測時細胞密度不超過80%～90%滿。將各培養孔分成如下幾組：包括無細胞的培養液孔（背景空白對照孔），未經藥物處理的對照細胞孔（樣品對照孔），未經藥物處理的用于后續裂解的細胞孔（樣品最大酶活性對照孔），以及PQ 400 μmol/L處理的細胞孔，800 μmol/L處理的細胞孔，每組3個復孔。處理48 h上酶標儀490 nm處各測一次OD值。測得的各組吸光度均應減去背景空白對照孔吸光度后根據公式計算細胞死亡率，細胞死亡率（%）=（處理樣品吸光度-樣品對照孔吸光度）/（細胞最大酶活性的吸光度-樣品對照孔吸光度）×100。

1.6CCK-8法檢測計算耐藥指數（RI） 分別取對數生長期、生長狀況良好的親本A549細胞和A549/PQ細胞，接種到96孔板中，5×103/孔，每種細胞分成空白對照孔（無細胞有培養基），未經藥物處理孔，PQ 400 μmol/L處理的細胞孔，800 μmol/L處理的細胞孔，1 200 μmol/L處理的細胞孔，每組3個復孔，處理48 h后上酶標儀450 nm處各測OD值。公式計算細胞抑制率，細胞抑制率（%）=100-［A（加藥）-A（空白）］/［A（未加藥）-A（空白）］×100。利用GraphPad Prism 5軟件求半數抑制濃度（IC50）。RI等于A549/PQ細胞的IC50/親本A549細胞的IC50。

1.7PI染色流式細胞術檢測細胞周期 分別取對數生長期、狀況良好的親本A549細胞和A549/PQ細胞，胰酶消化，1 000 r/min離心5 min去上清，1 mL PBS重懸，再次1 000 r/min離心5 min去上清，加入1 mL預冷無水乙醇，輕輕吹打混勻，4 ℃固定12 h。將固定好的細胞懸液1 000 r/min離心5 min去上清，每管細胞樣品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細胞沉淀，37 ℃避光溫浴30 min，上流式細胞儀檢測細胞周期。

1.8統計學處理方法 采用SPSS 19.0統計軟件。數據以±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。采用GraphPad Prism 5.0軟件制圖。

2　結果

2.1光鏡下觀察細胞形態 普通光鏡見A549/PQ體積較親本A549體積增大，且A549/PQ細胞形態呈多態化，不規則，細胞邊界模糊，細胞內顆粒增多，有抱團生長現象（見圖1B），而親本A549形態規則，排列整齊（見圖1A）。

2.2細胞生長曲線和倍增時間 A549/PQ和親本A549細胞的生長曲線見如圖2。親本A549細胞的倍增時間是（36.6±7.64）h，A549/PQ細胞的倍增時間（59.67±20.48）h，兩者差異有統計學意義（P＜0.01，見圖3。

2.3細胞對PQ的敏感性 親本A549和耐藥A549/PQ在不同PQ濃度誘導下死亡率見圖4。PQ濃度為400 μmol/L，親本A549死亡率為（26.15±1.19）%，耐藥A549/PQ死亡率為（17.39±2.18）%，2組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；PQ濃度為800 μmol/L時，A549死亡率為（43.59±4.78）%，A549/PQ死亡率為（26.65±2.91）%，2組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1　光鏡下A549和A549/PQ細胞形態（×200）

圖2　A549/PQ和親本A549細胞生長曲線

圖3　A549和A549/PQ細胞倍增時間比較

圖4　PQ誘導A549和A549/PQ細胞死亡率的比較

2.4細胞存活率及RI 不同濃度PQ暴露后A549與A549/PQ細胞存活率曲線見圖5。利用GraphPad Prism 5.0軟件求得A549對PQ的IC50為（215.03±63.62）μmol/L，A549/PQ對PQ的IC50為（1716.33±184.78）μmol/L，如圖6所示，2組間差異具有統計學意義（P＜0.05）。A549/PQ的RI為7.98，A549/PQ對PQ中度耐受。

圖5　PQ暴露后A549和A549/PQ細胞生存率曲線

圖6　PQ誘導A549和A549/PQ細胞IC50的比較

2.5細胞周期分布 細胞周期分布見表1。與A549比較，A549/PQ細胞G0/G1期細胞明顯增多，S期細胞明顯減少（P＜0.05）。

表1　A549/PQ與A549細胞周期分布的比較（%，n=3，±s）

3　討論

體外建立耐藥細胞株是研究腫瘤耐藥特性及機制的重要手段。目前，已有多種誘導建立耐藥細胞系的方法，主要包括濃度遞增連續誘導法和高劑量間斷暴露法兩大類［6］。一般認為，濃度遞增連續誘導的方法是通過藥物持續作用，使腫瘤細胞生理和遺傳特性發生改變以逐漸適應藥物的毒性，屬于獲得性耐藥，這種方法誘導成功率高［7］。本研究中，我們在濃度遞增連續暴露方法的基礎上進行了改進，即充分考慮濃度逐漸遞增的同時，又在同一濃度下采用逐漸延長暴露時間的方法，為A549細胞激活相關代償途徑提供緩沖時間，有利于細胞逐漸地適應PQ的毒性，從而獲得對PQ的耐藥性，提高誘導成功率。迄今未見應用這種辦法誘導建立對PQ耐藥人體細胞系的報道。

光鏡下觀察顯示耐藥A549/PQ細胞體積增大，邊界模糊，細胞內顆粒增加，表明耐藥細胞的代謝、分裂活動減弱。有研究［8-10］報道，耐藥細胞的生長減慢，也有研究［11］認為耐藥細胞生長與親本細胞相近。本研究發現對PQ耐藥的A549細胞倍增時間明顯延長。流式細胞術分析其細胞周期，表明A549/PQ細胞G0/G1期細胞明顯多于親本A549細胞，S期細胞明顯少于親本細胞，說明耐藥株細胞DNA復制延長，增殖能力明顯減弱，細胞生長緩慢。可見A549/PQ細胞在形態學及生長方面均與親本細胞存在明顯差異。我們進一步分析了A549/PQ細胞對PQ的抗性作用。CCK-8是檢測細胞增殖能力的敏感方法。結果發現，與親本細胞比，PQ暴露后耐藥A549/PQ細胞存活率明顯高于親本細胞，其RI為7.98，據Snow等［12］的標準，為中度耐藥。LDH釋放實驗結果也顯示，同一濃度PQ誘導的A549/PQ細胞死亡率明顯低于親本細胞，顯示了耐藥A549/PQ細胞對PQ毒性具有良好的耐受性。

近年，全國PQ急性中毒患者呈倍數增長［13-14］，臨床上缺乏有效的救治措施，病死率高達50%以上，已成為急性中毒救治的突出難題［3］。肺臟是PQ中毒損傷的主要靶器官，中毒患者多死于急性肺損傷及肺纖維化，其機制復雜，涉及氧化應激、炎癥損傷、細胞凋亡等，尚未闡明［15-18］。A549細胞株是來源于人肺腺上皮的腫瘤細胞，本研究選擇該細胞株進行耐藥株培養，具有一定的代表意義。A549/PQ細胞長期經PQ的暴露，逐漸形成對PQ毒性的拮抗能力。發掘其拮抗PQ毒性的機制，將為PQ的毒理機制及干預研究提供大量有價值的信息。此外，由于PQ是一種強氧化劑，A549/PQ細胞株同時也為氧化應激損傷機制研究提供良好的細胞模型。

［1］Gawarammana IB， Buckley NA. Medical management of paraquat ingestion［J］. Br J Clin Pharmacol， 2011， 72（5）: 745-757.

［2］Dinis-Oliveira RJ， Duarte JA， Sánchez-Navarro A， et al. Paraquat poisonings: mechanisms of lung toxicity， clinical features， and treatment［J］. Crit Rev Toxicol， 2008， 38（1）: 13-71.

［3］中國醫師協會急診醫師分會. 急性百草枯中毒診治專家共識（2013）［J］. 中國急救醫學， 2013， 3 3（6）: 484-489.

［4］An J， Shen X， Ma Q， et al. Transcriptome profiling to discover putative genes associated with paraquat resistance in goosegrass （Eleusine indica L.）［J］. PLoS One， 2014， 9（6）: e99940.

［5］Fujita M， Fujita Y， Iuchi S， et al. Natural variation in a polyamine transporter determines paraquat tolerance in Arabidopsis［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2012， 109（16）: 6343-6347.

［6］蔣東海. 新型乳腺癌耐藥細胞的建立、鑒定及耐藥逆轉［D］. 杭州: 浙江大學， 2011: 9-11.

［7］Negoro K， Yamano Y， Fushimi K， et al. Establishment and characterization of a cisplatin-resistant cell line， KB-R， derived from oral carcinoma cell line， KB［J］. Int J Oncol，2007， 30（6）: 1325-1332.

［8］王建軍， 趙暉， 林峰， 等. 耐甲氨蝶呤人骨肉瘤細胞株建立及其生物學特性［J］. 腫瘤， 2007， 27（8）: 623-627.

［9］董梅， 林晨， 馮奉儀， 等. 人肺腺癌吉西他濱耐藥細胞系的建立及其特性［J］. 癌癥， 2004， 23（6）: 6 67-671.

［10］張會軍， 閻蘊力， 鄭力芬， 等. 人小細胞肺癌多藥耐藥細胞系H446/VP的建立及其生物學性狀［J］. 腫瘤， 2004， 24 （3）: 233-236.

［11］陳公琰， 楊朝陽， 洪璇， 等. 人肺腺癌耐藥細胞模型的建立及生物學特性的初步鑒定［J］. 中華醫學雜志， 2007， 87（13）: 924-926.

［12］Snow K， Judd W. Characterisation of adriamycin- and amsacrine-resistant human leukaemic T cell lines［J］. Br J Cancer，1991， 63（1）: 17-28.

［13］張寶蘭， 姚朗， 歐藝. 1991-2008年我國百草枯中毒文獻分析［J］. 中國急救醫學， 2010， 30（2）: 139-141.

［14］盧中秋， 洪廣亮， 趙光舉， 等. 百草枯急性中毒救治中的幾個焦點問題［J］. 中華勞動衛生職業病雜志， 2013， 31（5）: 395-397.

［15］彭曉東， 陳驥， 梁創. 急性百草枯中毒后MODS患者血清TNF-α和IL-10的變化及意義［J］. 中國實用醫藥， 2008， 3 （14）: 9-11.

［16］盧中秋， 賀曉艷， 洪廣亮， 等. 二巰丙磺鈉對急性百草枯中毒大鼠肺損傷的保護作用［J］. 中華內科雜志， 2009， 48 （3）: 233-234.

［17］Hong GL， Liu JM， Zhao GJ， et al. The reversal of paraquatinduced mitochondria-mediated apoptosis by cycloartenyl ferulate， the important role of Nrf2 pathway［J］. Exp Cell Res， 2013， 319（18）: 2845-2855.

［18］Cai Q， Lu Z， Hong G， et al. Recombinant adenovirus Ad-RUNrf2 reduces paraquat-induced A549 injury［J］. Hum Exp Toxicol， 2012， 31（11）: 1102-1112.

（本文編輯：吳健敏）

Establishment and characterization of a Paraquat-resistant human lung adenocarcinoma cell line A549/PQ

HONG Guangliang， TAN Jiaping， DING Yingwei， ZHAO Guangju， LI Mengfang， LU Zhongqiu. Department of Emergency Medicine， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325015

Objective: To establish Paraquat （PQ）-resistant A549 cell line （A549/PQ） and explore its biological characteristics. Methods: The A549 cells were periodically co-cultured with PQ at gradually increasing concentrations， and its biological characteristics were observed. The morphological features were checked with light microscope. Sensitivity to PQ was detected by LDH assay. The cell growth curve and doubling time were studied by cell counting. CCK-8 assay was used to measure the median inhibitory concentration （IC50） and resistance index （RI） of A549/PQ cells and flow cytometry was applied to evaluate the cells cycle distribution. Results: Compared with A549 cells， the changes for larger size， irregular shape and much wide cell gap were found in A549/PQ cells. LDH release induced by PQ in A549/PQ cells was significantly lower than that of A549 cells （P＜0.05）. CCK-8 assay showed higher IC50in A549/PQ cells than that in A549 cells （1716.33 & 215.03 μmol/L，P＜0.05） and RI was 7.98 in A549/PQ cells. Longer doubling time， increased G0/G1 phase cells and decreased cells in S phase were found in A549 cells （P＜0.05）. Conclusion: We successfully constructed a PQ-resistant A549 cell line with significantly different biological characteristics and therefore a good cellular model for PQ toxicity research.

Paraquat； resistant cell line； biological characteristics

R459.7

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.11.001

2015-02-01

浙江省醫學創新學科建設計劃（11-CX26）；浙江省十二五高校重點學科；浙江省中醫藥重點學科建設計劃（2012-XK-A28）。

洪廣亮（1979-），男，浙江淳安人，主治醫師，博士。

盧中秋，教授，主任醫師，博士生導師，Email：lzq 640815@163.com。