p53、HER－2和Ki－67基因表達(dá)與結(jié)直腸腺癌臨床病理特征的關(guān)系研究

艾尼娃爾·巴巴依

（新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院 病理科，新疆 烏魯木齊830001）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化道常見的惡性腫瘤，全世界每年約100萬人發(fā)生CRC，且患者5年病死率高達(dá)50%［1］。近年來，CRC在我國的發(fā)病率和死亡率居各種惡性腫瘤的前列，且呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)［2］。CRC腫瘤組織轉(zhuǎn)移、侵襲是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。P53基因是一種抑癌基因，在正常細(xì)胞中表達(dá)水平較低，具有抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用［3］，而其發(fā)生突變后，喪失了抑癌作用，且具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用［4］。Ki－67是增殖細(xì)胞最明顯的標(biāo)志，可用于腫瘤惡性程度的判斷，與腫瘤臨床分期、組織學(xué)分級(jí)相關(guān)［5］。人類表皮生長因子受體2基因（Human epidermal growth factor receptor 2，HER－2）是一種原癌基因，與多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后存在相關(guān)性，其陽性表達(dá)多見于肺癌、胃癌、前列腺癌等［6］。因此，筆者選擇2009年1月—2014年1月在我院行手術(shù)切除的CRC患者80例為研究對(duì)象，探討P53、ki－67和 HER－2基因表達(dá)與CRC臨床病理特征的關(guān)系，以期為臨床CRC的診斷、治療和預(yù)后判斷提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2009年1月—2014年1月在我院行手術(shù)切除的80例CRC患者為研究對(duì)象，其中男42例，女38例，年齡31－76歲，平均年齡（56.37±8.29）歲；病變部位：直腸 42例（52.50%），左半結(jié)腸（包括乙狀結(jié)腸、結(jié)腸脾曲及乙直交界）21例（26.25%），右半結(jié)腸（包括橫結(jié)腸、結(jié)腸肝曲及回盲部）17例（21.25%）。所有CRC患者術(shù)前均未進(jìn)行放療及化療治療，其中發(fā)生腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例（38.75%）；采用WHO 2010年提出的消化道腫瘤組織學(xué)分級(jí)及改良Dukes分期：A期41例，B例9例，C期30例，無D期患者。

1.2 方法

所有外檢標(biāo)本均在癌組織取下后，即刻用4%甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋后進(jìn)行連續(xù)切片，厚度約4μm。所得切片分別進(jìn)行P53、Ki－67和 HER－2檢測(cè)，P53及 Ki－67用檸檬酸鹽緩沖液高壓加熱3min進(jìn)行修復(fù)，HER－2采用EDTA修復(fù)液（購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）進(jìn)行修復(fù)。采用3%雙氧水進(jìn)行孵育10min后分別滴加P53、Ki－67及HER－2抗體，置于4℃環(huán)境下過夜，采用DAB進(jìn)行顯色，出現(xiàn)棕黃色為陽性。采用蘇木精進(jìn)行復(fù)染3min，用自來水沖洗，1%的鹽酸酒精進(jìn)行分化，自來水返藍(lán)5min，置于65℃烤箱烤干，利用中性樹膠進(jìn)行封片。利用PBS代替第一抗體作為陰性對(duì)照，陽性對(duì)照由試劑公司提供。兔抗人Ki－67單克隆抗體、鼠抗人P53單克隆抗體及免疫組化EliVisionTM super試劑盒（兔/鼠）均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；鼠抗人HER－2單克隆抗體購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。所有試驗(yàn)操作均由檢驗(yàn)科專業(yè)人員嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范進(jìn)行。

1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

P53評(píng)判依據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞核染色強(qiáng)度：陽性細(xì)胞數(shù)≥75%記4分，51%－74%記3分，26%－50%記2分，≤25%記1分；細(xì)胞核染色呈現(xiàn)棕褐色記3分，棕黃色記2分，談棕色記1分；陽性細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞核染色強(qiáng)度評(píng)分之和：≤1分為（－），2－3分（＋），4－5分（＋＋），≥6分（＋＋＋）；Ki－67評(píng)價(jià)分為三級(jí)：陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為（－），10%－50%為（＋），＞50%為（＋＋），HER－2的評(píng)判采用2011年胃癌 HER－2檢測(cè)指南。本研究結(jié)果由我院2名中級(jí)以上病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料分析采用Spearman秩相關(guān)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P53、Ki－67和 HER－2表達(dá)情況

P53和Ki－69染色后表達(dá)于細(xì)胞核，被染成棕黃色或棕褐色細(xì)胞顆粒狀，見圖1、2，其陽性率分別為61.25%（49/80）和76.25%（61/80）；HER－2表達(dá)于細(xì)胞膜，染色后呈現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒狀，見圖3，其陽性表達(dá)率為28.75%（23/80）。

2.2 P53、Ki－67和 HER－2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

本研究顯示，P53在腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移中陽性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝6.235，4.248，P＜0.05）；Ki－67在腫瘤大小、浸潤程度及Dukes分期中陽性比達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝7.222，6.589，5.011，P＜0.05）；HER－2在浸潤程度、淋巴轉(zhuǎn)移及Dukes分期中陽性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝5.725，4.296，4.984，P＜0.05）；P53、Ki－67和HER－2在其他病理特征中陽性表達(dá)率均無明顯差異（P＞0.05），見表1。

圖1 CRC P53（＋）細(xì)胞核染色結(jié)果

圖2 CRC Ki－67細(xì)胞核染色結(jié)果

圖3 CRC HER－2（＋）細(xì)胞膜染色結(jié)果

2.3 P53與 Ki－67和 HER－2表達(dá)相關(guān)關(guān)系

Spearman相關(guān)分析顯示，P53陽性表達(dá)與 Ki－67和HER－2陽性表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.231，0.142，P＜0.05），Ki－67陽性表達(dá)與 HER－2陽性表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.139，P＜0.05）。

3 討論

CRC是我國最常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于肺癌和胃癌，位居第三位。研究顯示［7，8］，RCR的發(fā)病機(jī)制受遺傳和內(nèi)外環(huán)境共同影響，涉及多因素、多步驟及多階段的病理過程，主要包括組織上皮細(xì)胞分化、增殖、存活和凋亡機(jī)制的紊亂。其中，基因水平的改變是發(fā)病的重要原因。P53是近年來發(fā)現(xiàn)的一種與人類腫瘤發(fā)生存在高度相關(guān)的基因［9］。目前發(fā)現(xiàn)，P53基因存在野生型和突變型兩種，其中前者存在于人體正常細(xì)胞中，具有抑癌作用，對(duì)細(xì)胞增殖和分裂起到負(fù)調(diào)控作用；突變型不僅喪失了抑癌作用，且獲得了癌基因具有的功能，能夠促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。研究顯示，腫瘤組織中突變型P53表現(xiàn)為高表達(dá)，如相關(guān)研究報(bào)道的胃腸癌中P53蛋白陽性率達(dá)20%－60%、結(jié)腸癌P53突變率高于70%等，且其高表達(dá)與腫瘤的惡性程度相關(guān)［10］。

表1 CRC中P53、Ki－67和HER－2表達(dá)與臨床病例特征的關(guān)系

本研究顯示，CRC患者P53基因的陽性表達(dá)率為61.25%，與既往研究基本一致［11］。此外，P53在腫瘤大小和淋巴轉(zhuǎn)移分組中陽性表達(dá)率存在明顯差異（P＜0.05），說明P53高表達(dá)預(yù)示腫瘤組織具有較高的侵襲力和轉(zhuǎn)移能力，可作為預(yù)測(cè)CRC預(yù)后的指標(biāo)。Ki－67是目前標(biāo)志細(xì)胞增殖最可靠和簡單的方法，Ki－67在細(xì)胞分裂G0期和G1早期一般不表達(dá)，在G1中晚期開始表達(dá)然后逐漸升高，M期達(dá)到高峰，可以用于細(xì)胞增殖的定量分析，判斷腫瘤的惡性程度，探討腫瘤組織的浸潤方式、生長方式、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為［12］。研究顯示，多種腫瘤組織中Ki－67高表達(dá)的患者，預(yù)后一般較差。本研究顯示，Ki－67的陽性表達(dá)率為76.25%，且在不同腫瘤大小、浸潤程度及Dukes分期中Ki－67的陽性表達(dá)率存在差異（P＜0.05），說明Ki－67較高的陽性表達(dá)率代表腫瘤組織增生活躍，容易發(fā)生腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后效果差［13］。HER－2基因在細(xì)胞正常分裂和生長中起重要的作用，病理情況下其高表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤組織新生血管生成及提高細(xì)胞侵襲力。此外，HER－2的陽性表達(dá)率為28.75%，其在不同浸潤程度、淋巴轉(zhuǎn)移及Dukes分期中陽性表達(dá)率存在明顯差異（P＜0.05），說明HER－2的表達(dá)在腫瘤細(xì)胞侵襲性生長與轉(zhuǎn)移中存在一定作用，其表達(dá)率越高，腫瘤的侵襲力、轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)，患者預(yù)后效果差。

本研究顯示，P53陽性表達(dá)與Ki－67和HER－2陽性表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)（P＜0.05），Ki－67陽性表達(dá)與 HER－2陽性表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)（P＜0.05），其原因可能是因?yàn)镻53的生物學(xué)作用是抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，增加疾病進(jìn)展，而Ki－67的表達(dá)在細(xì)胞分裂M期達(dá)到高峰，反映腫瘤細(xì)胞增殖活性，HER－2可以促進(jìn)腫瘤組織新生血管生成及提高細(xì)胞侵襲力，因此，三者均能反應(yīng)疾病的進(jìn)展和惡性程度。而研究報(bào)道HER－2與患者預(yù)后的生存率存在相關(guān)性［14］，因此，較高表達(dá)的P53、Ki－67和HER－2預(yù)示著患者預(yù)后較差，存活率較低。

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