吉林地區尖銳濕疣疣體內高危型人乳頭瘤病毒的檢測與分型

叢樂樂，崔傳信，楊宏鳳，趙 晴，李曉麗

（吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033）

尖銳濕疣（CA），是由人乳頭瘤病毒（HPV）感染所致的以生殖器部位增生性損害為主要表現的疾病，具有較強的傳染性和較高的復發率，并以亞臨床感染的形式存在于人體中，根據致癌性的高低，將HPV分為低危型、高危型，感染型別多為低危型，多無癌變傾向，高危型HPV持續感染是99%以上宮頸癌發生的必要條件［1］。各地區流行病學調查研究發現，不同地區不同人群的HPV感染型別有著較大的區別，對尖銳濕疣患者HPV感染亞型的調查，可對患者的治療預后進行有效的判斷，具有極其重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 2012年3月至2014年2月就診于自吉林大學第三醫院的皮膚科門診尖銳濕疣患者，記錄患者姓名，性別，年齡，疣體位置，大小，形態，病史，治療史。

1.1.2 標本收集 對經臨床和醋白試驗證尖銳濕疣患者，簽知情同意書，局麻，剪取3mm×3mm大小疣體組織。將其放入備有1ml無菌生理鹽水的試管中，標記，放入－20℃冰箱中冷藏備用。

1.1.3 試劑與儀器 高危型人乳頭瘤病毒（HPV）分型核酸測定試劑盒（上海之江生物科技股份有限公司）。ABI Prism?7000型熒光定量PCR儀。

1.2 方法

采用HPV13種型別的特異性引物及熒光探針，應用聚合酶鏈式反應（PCR）結合Tapman技術，對HPV13種型別的特異性DNA核酸片段進行分型檢測。

1.2.1 樣本DNA提取 取約50mg組織于試管中，置室溫解凍，研磨，加入1ml生理鹽水，充分震蕩搖勻，將液體轉移至1.5ml離心管中，以13，000 rpm離心5min。沉淀加無菌生理鹽水1ml混勻，以13，000rpm離心5min，棄上清。沉淀后直接加入100μl核酸提取液充分混勻，沸水浴10min后13，000rpm離心5min，取上清4μl作為PCR反應模板。

1.2.2 質量控制 H2O檢測結果應為儀器FAM、VIC通道Ct欄均顯示UNDET（ABI Prism?7000）或循環閾值欄均顯示40（SLAN熒光定量PCR檢測系統），陽性對照品檢測結果應為Ct值≤35，否則實驗視為無效。結果判斷Ct值等于40.0或UNDET的樣本為陰性，Ct值≤35的檢測樣本為陽性。

2 結果

2.1 HPV感染型別分布 280例疣體樣本中，HPV高危型陽性例數為76例，感染率為27.14%。檢測的13種亞型均有出現。檢出率前7位感染的HPV亞型分別為 HPV16，18，59，58，56，33，39。見表1。

表1 HPV感染的型別分布（前7位）

2.2 HPV高危型多重感染分布 280例尖銳濕疣患者共檢測出高危型HPV 76例，其中單一型感染35例（46.1%），多重感染41例（53.9%）。其中二重感染21例，（27.6%）；三重感染14例，（18.4%）；四重感染4例，（5.3%）；五重感染2例，（2.6%）

2.3 不同年齡段HPV高危型感染率比較 本研究共收集280例尖銳濕疣患者，年齡最小20歲，最大67歲，平均37.6歲，年齡中位數為37歲，20－29歲102例，占36.4%。50歲以上32例。見表2。

表2 尖銳濕疣患者性別及年齡分布（n/%）

可見，20－29歲為高發年齡段，均高于其他各組。采用SPSS11.5χ2統計分析軟件分析，不同年齡段男女患者發病情況無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

3.1 HPV高危型單一感染和多重感染的情況HPV由于各種亞型之間編碼外殼蛋白是基因變異較大，不同亞型病毒之間基本上沒有交叉保護性抗體，容易造成不同亞型HPV的多重感染和多次感染，HPV多重感染發生宮頸癌的風險比單一型別感染增加1.5倍［2］。本實驗中尖銳濕疣組織中共檢測出高危型 HPV感染率為27.14%（76/280），多重感染高達53.9%（41/76）。關于HPV多重感染是否會增加宮頸癌的風險，目前尚無統一意見，但更多學者傾向認為，HPV多重感染更易導致宮頸病變，增加宮頸癌的風險。

3.2 HPV感染的高發年齡 有研究表明，在292例HPV陽性的尖銳濕疣患者中，HPV構成比以20－29歲年齡段最高［3］。雷振春等［4］在780例尖銳濕疣患者中證明HPV陽性構成比最高的年齡段在20－29歲，與本文相符。但是從統計學上來說，20－29歲年齡段與30－39歲年齡段的發病率并無差異，兩個年齡段的發病率相加高達68.57%。由此可見，20－39歲為HPV感染的高發年齡。其原因可能與該年齡段的患者性生活相對頻繁有關系。

3.3 熒光定量PCR檢測HPV基因型意義 熒光定量 PCR （Quantitative Real－time PCR）是 一 種 在DNA擴增反應中，以熒光化學物質檢測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析。實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現了每輪循環均可檢測熒光信號強度，并記錄，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。能一次性檢測出多種不同的基因序列，具有快速、簡便、高效、高敏感性、高特異性等特點，尤其適用于基因分型、病原體的檢測等方面。因此適于研究HPV感染的流行病學和正常人HPV感染篩查。

3.4 HPV相關疾病的流行病學調查 經流行病學調查發現，宮頸癌、肛門癌和外生殖器癌、喉癌與HPV 的相關性約為100%、85%、50%［5］。2004－2008年在美國，每年有新的HPV相關口咽鱗癌病例報告多達12000例，過去20－30年里增長了高達225%［6］。有學者認為，HPV－16在HNSCC的進程中是至關重要的因素［7］。陰莖癌最常見于50－70歲左右的男性，在發展中國家有著較高的患病率，約10%。在侵襲性陰莖腫瘤組織中HPV16高達60.2%，是最常見的型別，其次為 HPV18（13.3%）［8］。宮頸癌是婦女發病率較高的惡性腫瘤，全球每年新發宮頸癌患者約為45萬人，有22萬人死于該病［9］。

綜上所述，高危型HPV與多種腫瘤的發生、發展密切相關。因此，HPV分型檢測是宮頸癌等病變篩查的必要手段。通過分型檢測進行個體化評估，預測腫瘤發生的風險度，從而決定篩查的間隔，選擇和制定治療方案。結果也可為監測疫苗的效果及為未來制作相應型別的疫苗提供理論依據。

［1］Richa Tripathi，Gayatri Rath，et al.Clinical Impact of De－Regulated Notch－1and Notch－3in the Development and Progression of HPVAssociated Different Histological Subtypes of Precancerous and Cancerous Lesions of Human Uterine Cervix［J］.PLoS One，2014，9（6）：e98642.

［2］Lee SA，Kang D，Seo SS，et al.Multiple HPV infection in cervical cancer screened by HPV DNA Chip［J］.Cancer Lett，2003，198（2）：187.

［3］阮建波，陳冬萍，朱瑞清.302例尖銳濕疣患者人乳頭瘤病毒基因型檢測及分析［J］.皮膚性病診療學雜志，2011，18（1）：37.

［4］雷振春，鄭一斐，汪英俊，等.尖銳濕疣患者人乳頭瘤病毒的感染與基因分型研究［J］.中華醫院感染學雜志，.2015，25（7）：1475.

［5］Giuliano AR，Tortolero－Luna G，Ferrer E，et al.Epidemiology of human papillomavirus infection in men，cancers other than cervical and benign conditions［J］.Vaccine，2008，26（Suppl 10）：K17.

［6］Wu X，Watson M，Wilson R，et al.Human papillomavirus－associated cancers－United States，2004 – 2008［J］.Morb Mortal Wkly Rep，2012，61（15）：258.

［7］Vietía D，Liuzzi J，Avila M，et al.Human papillomavirus detection in head and neck squamous cell carcinoma［J］.Ecancermedicalscience，2014，23；8：475.

［8］Miralles－Guri C，Bruni L，Cubilla AL，et al.Human papillomavirus prevalence and type distribution in penile carcinoma［J］.J Clin Pathol，2009，62：870.

［9］Parkin DM，Bray FI，Devesa SS.Cancer burden in the year 2000：the global Picture［J］.Eur J Cancer，2001，37：S4.