乙肝病毒變異檢測中基因芯片技術的臨床應用價值分析

曹 玲，朱 凡，曾崇亮

（成都市公共衛生臨床醫療中心 檢驗科，四川 成都610066）

乙肝是我國重點控制的傳染病之一。乙肝病毒常常會因為受到人體免疫力、自然選擇壓力和抗病毒藥物等因素影響而發生變異，這些變異可能會導致乙肝病毒出現致病性發生改變、產生耐藥性和免疫逃逸等情況發生，因而給臨床診治造成極大的困擾［1，2］。本文希望通過探討乙肝病毒變異檢測中基因芯片技術的臨床應用價值，為臨床乙肝疾病診治提供參考依據。現在報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2013年確診為慢性乙肝疾病的患者200例作為研究對象，患者病情均符合《病毒性肝炎防治方案》（2000年9月西安會議修訂）的診斷標準，其中男性109例，女性91例，年齡在26歲至48歲之間，平均年齡（30.15±5.32）歲，研究對象檢測時均未服用拉米夫定或干擾素等藥物治療，且沒有丙型肝炎疾病和丁型肝炎疾病的重疊感染。研究對象根據病情程度可分為慢性重型肝炎22例、重度慢乙肝38例、中度慢性乙肝81例和輕度慢性乙肝59例。

1.2 標本采集與處理

研究對象均于納入次日清晨由專業護士采集空腹靜脈血2.0ml，經過3 000r/min低速離心分離血清10min，取其中20μl血清和30μl裂解液震蕩混勻，將混合液放入沸水浴10min，然后再經過13 000r/min高速離心10min，取上層液體在PCR儀器上進行擴增，循環程序為擴增94℃預變性4min，然后94℃變性30s，然后再72℃延伸擴增30s，72℃再經過4min，循環30次后形成熒光標記的待測物。

1.3 方法

基因芯片由上海瑞芯生物科技有限公司提供，芯片固定了針對前C區、BCP區以及P區YMDD6位點共14條探針，待測基因使用地高辛標記，芯片雜交后在尼龍膜上進行轉印并經過光學掃描儀掃描到該公司配套的乙肝動態性分析軟件進行分析，芯片雜交、顯色和結果判斷均嚴格按照配套說明書執行。另外患者血清采用美國ABI7500型號PCR儀器進行熒光定量檢測。

1.4 統計處理

PCR熒光定量檢測結果使用對數均值表示，統計采用SPSS19.0統計學軟件進行，計數資料使用卡方檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

21 乙肝前C區、BCP區變異情況分析，見表1由表1可見，前C區A1896和前C區A1814同時變異13例，占前C區變異總數的10.0%（13/130）；BCP區nt1762和BCP區nt1764聯合變異98例，占BCP 區總變異數的83.1%（98/118）；前 C 區A1896和BCP區nt1762/nt1764聯合變異79例，占BCP區nt1762/nt1764聯合變異數的80.6%（79/98）。

表1 乙肝前C區、BCP區變異情況分析

2.2 患者病情程度與乙肝前C區、BCP區變異情況分析，見表2。由表2可見，慢性重型肝炎患者變異發生率最高，然后依次是重度慢性乙肝、中度，輕度慢性乙肝變異發生率最低，且與其余三類病情患者兩兩比較，差異顯著，具有統計學意義（P＜0.05）。

表2 患者病情程度與乙肝前C區、BCP區變異情況分析

2.3 乙肝病毒DNA復制程度與乙肝前C區、BCP區變異情況分析，見表3。由表3可見，患者乙肝病毒DNA定量在＜104copy/ml時變異發生率最低，104－106copy/ml時 變 異 發 生 率 最 高，其 次 為 ＞106copy/ml，且組間差異顯著，具有統計學意義（P＜0.05）。

表3 乙肝病毒DNA復制程度與乙肝前C區、BCP區變異情況分析

2.4 血清e系統與乙肝前C區、BCP區變異情況分析，見表4。由表4可見，HBeAg（－）HBeAb（＋）患者變異發生率最高，其次為 HBeAg（－）HBeAb（－）患者和 HBeAg（＋）HBeAb（－）患者，且組間差異顯著，具有統計學意義（P＜0.05）。

表4 血清e系統與乙肝前C區、BCP區變異情況分析

3 討論

基因芯片又叫基因微矩陣，是近年來分子生物和醫學診斷技術發展的重要產物［3，4］。基因芯片的應用原理是將大量寡核苷片段或特定基因片段作為探針高密度有序地固定排列在硅或玻璃上，然后與待測熒光標記的樣本核酸按照堿基配對原則進行雜交，通過激光共聚系統檢測雜交信號，經計算機分析處理從而獲得樣本分子數量和序列信息［5，6］。基因芯片具有高通量、快速并行等優點，能夠一次性對大量序列進行檢測分析，從而解決了傳統核酸印記雜交操作繁雜、自動化程度低、效率低下等缺點，對于病毒學研究尤其是病毒基因表達研究、病毒感染等具有積極的臨床價值［7，8］。

乙肝病毒的逆轉錄復制機理使得乙肝病毒變異較為常見，內源性和外源性選擇壓力下很容易產生免疫逃避變異株［9，10］。本文結果顯示，由表1可見，乙肝病毒前C區A1896、A1814、BCP區nt1762和BCP區nt1764變異陽性率分別為58.5%、13.0%、55.0%、53.0%，前C區A1896和前C區A1814同時變異13例，占前C區變異總數的10.0%（13/130）；BCP區nt1762和BCP區nt1764聯合變異98例，占BCP區總變異數的83.1%（98/118）；前 C區A1896和BCP區nt1762/nt1764聯合變異79例，占BCP區nt1762/nt1764聯合變異數的80.6%（79/98），說明患者未使用任何抗病毒藥物時體內的乙肝病毒容易發生變異。由表2可見，慢性重型肝炎患者變異發生率最高，然后依次是重度慢性乙肝、中度，輕度慢性乙肝變異發生率最低，且與其余三類病情患者兩兩比較，差異顯著，具有統計學意義（P＜0.05），表明隨著患者病情加重，乙肝病毒的變異情況發生情況逐步增多。由表3可見，患者乙肝病毒DNA定量在＜104copy/ml時變異發生率最低，104－106copy/ml時 變 異 發 生 率 最 高，其 次 為 ＞106copy/ml，且組間差異顯著，具有統計學意義（P＜0.05），說明乙肝病毒前C區和BCP區變異情況與乙肝病毒DNA復制程度有關，但并不是復制程度越高變異情況發生率越大。HBeAg由前C/C基因表達，受到C基因啟動子調控，BCP區是乙肝病毒前C區mRNA轉錄的重要元件，BCP區nt1762和BCP區nt1764聯合變異能通過影響前C區mR－NA轉錄從而影響HBeAg的表達，乙肝病毒前C區和BCP區變異能夠使HBeAg不表達［11］；從表4可見，HBeAg（＋）患者前C區變異率為19.4%，BCP區為0.0%，但在HBeAg（－）患者中前C區變異率為75.0%（123/164）和72.0%（118/164）就得到充分證實。

綜上所述，臨床醫生應該對于 HBeAg（－）和乙肝病毒DNA復制程度＞104copy/ml的患者要充分考慮到乙肝病毒變異，加強監測，預防慢重肝的發生。

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