多種方法檢測視神經脊髓炎患者血清及腦脊液中水通道蛋白4抗體的臨床應用

李 敏，秦新月

（1.重慶市第七人民醫院 神經內科，重慶400054；2.重慶醫科大學附屬第一醫院 神經內科，重慶400016）

水通道蛋白4抗體（anti－aquaporins 4，AQP4－Ab）是近年來發現的對于視神經脊髓炎（nuromylitis optica，NMO）有較高特異性及敏感性的檢驗指標［1］，可用于與多發性硬化（multiple sclerosis，MS）的鑒別。臨床上對水通道蛋白4抗體的檢測方法的研究較為廣泛，目前的檢測方法有細胞免疫共沉淀法、放射免疫共沉淀法、組織間接免疫熒光檢測、細胞免疫熒光法及酶聯免疫吸附測定法等［2］，各種方法優缺點不同。我院采用了后3種方法對125例患者的血清及腦脊液進行檢測分析，以此為臨床應用提供依據，結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

我院2009年1月至2014年12月收治的58例多發性硬化患者（MS組）及67例視神經脊髓炎患者（NMO組），年齡37－54歲，平均45.4±8.6歲，其中男38例，女87例。納入排除標準：①兩組患者分別符合NMO診斷標準［3］及 MS診斷標準［4］；②由兩名以上主任醫師做出診斷；③排除同時合并其他器質性或功能性神經系統疾病者；④排除疾病緩解期患者或1月內有免疫抑制劑及糖皮質激素治療者。50例健康受試者（對照組）均來自我院健康體檢中心。本次研究通過醫院倫理委員會批準，健康受試者、患者及家屬均簽署知情同意書。

3組間性別、年齡差異無統計學差異，NMO組患者與MS組患者間性別組成、年齡、起病年齡、病程均無統計學差異（P＞0.05），具有可比性。詳見表1。

表1 兩組患者一般情況比較

1.2 樣本采集與處理

所有共175例研究對象采集非抗凝血2ml，離心（4℃2 500r/min，20min）后去上清液，于－20℃保存備用。125例NMO與MS患者入院后行腰椎穿刺檢查，留取腦脊液標本0.2ml與血清一同保存。

1.3 檢測方法

組織間接免疫熒光檢測（indirect immunofluorescence assay，IIF）：參照檢測方法［5］，應用視神經（猴）/AQP4試劑盒（歐蒙醫學實驗診斷股份公司，德國，批號：FAll2c－1005－1）檢測 AQP4－IgG，具體操作步驟及陽性結果以說明書為標準。

細胞免疫熒光法（cell—based assay，CBA）：具體操作步驟參照檢測方法［6］，待檢測的血清及腦脊液標本與HEK－293T－AQP4細胞共同孵育后，采用熒光顯微鏡觀察。由于AQP4為跨膜糖蛋白，即細胞膜出現綠色熒光為陽性結果。

酶聯免疫吸附測定法（enzyme－linked im－munosorbent assay，ELISA）：采用抗AQP4抗體檢測試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司），具體操作步驟參照說明書。用酶標儀在450nm處讀取吸光度。陽性結果以說明書為標準。

1.4 統計學分析

所有數據用SPSS 17.0軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，NMO組及MS組一般資料比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料以百分比表示，采用χ2檢驗比較不同檢測方法間陽性率，敏感性及特異性差異。P＜0.05時，差異有統計學意義。

2 結果

2.1 比較不同方法檢測血清及腦脊液中AQP4－Ab陽性檢出率

3種方法檢測對照組血清中AQP4－Ab的表達陽性率均為0.0%。比較3種方法在NMO組與MS組患者血清及腦脊液中AQP4－Ab的陽性檢出率，NMO組患者的陽性檢出率有差異（P＝0.029，P＝0.001），其中，CBA對 AQP4－Ab的陽性檢出率最高，分別為73.1%及85.1%。詳見表2。

表2 不同方法檢測血清及腦脊液中AQP4－Ab陽性檢出率比較［例（%）］

2.2 比較不同方法檢測血清及腦脊液中AQP4－Ab敏感性及特異性

比較3種方法的敏感性：CBA＞IIF＞ELISA；比較3種方法的特異性：CBA＞ELISA＞IIF。其中，3種方法的敏感性有差異（χ2＝7.115，P＝0.029；χ2＝14.443，P＝0.001），3種方法的特異性無差異。

3 討論

視神經脊髓炎主要累及視神經與脊髓，是一種炎性脫髓鞘性疾病，其主要臨床表現為亞急性發病的不同程度的視力障礙、雙下肢癱瘓、感覺及二便障礙［7］，由于其與多發性硬化在臨床癥狀上具有相似性，臨床上對兩者是否為同一疾病的不同亞型存在廣泛的爭議。近年來隨著視神經脊髓炎病例報道的增多以及相關研究的進展［8－10］，視神經脊髓炎在臨床經過、神經影像學、血清學、免疫病理學等方面均與多發性硬化表現不一致。視神經脊髓炎受累的脊髓節段比較長，MRI特點為病灶長度在3個或3個以上椎體節段，稱之為縱向擴展性橫貫性脊髓炎，與之不同的是，多發性硬化的病灶以大腦半球為主，脊髓病灶很少超過2個椎體.且多位于脊髓周邊［11］。然而，由于視神經脊髓炎早期可出現腦部病灶，其與多發性硬化的預后有很大不同，因此，尋找能夠幫助早期診斷、鑒別的生物學標志將有助于對患者的治療。

AQP4－Ab又稱視神經脊髓炎特異性抗體（nuromylitis optica－IgG，NMO－IgG）是 Lennon［12］等于2004年發現的，存在與視神經脊髓炎患者的血清及腦脊液中，對于早期診斷鑒別視神經脊髓炎與多發性硬化具有重要意義。AQP4是分布于中樞神經系統的高選擇性的水跨膜轉運通道蛋白，其主要表達于腦膜表面、室管膜和腦室周圍，其他在下丘腦視上核、小腦、海馬齒狀回、中韁核、脈絡叢上皮、視網膜及視神經也可有表達［13］，不同部位的AQP4發揮各自功能，共同參與腦脊液的分泌、分布與重吸收，此外，對于腦內滲透壓、K＋的平衡及腦水腫的病理機制祈禱重要調節作用［14］。AQP4抗體能激活補體系統，引起中樞神經系統炎性脫髓鞘和壞死，誘導星型膠質細胞的損害［15］。

本次試驗主要研究了組織間接免疫熒光檢測、細胞免疫熒光法及酶聯免疫吸附測定法這三種方法檢測視神經脊髓炎患者血清及腦脊液中AQP4－Ab表達的臨床應用。通過試驗可以發現，3種方法中細胞免疫熒光法對AQP4－Ab的陽性檢出率最高，分別為血清中73.1%及腦脊液中85.1%，與文獻符合［16］，3 種方法的 敏感性比 較 為 CBA＞IIF＞ELISA，證明細胞免疫熒光法對AQP4－Ab的檢出最有優勢。此外，健康對照組血清中無一例檢出AQP4－Ab，MS組患者血清及腦脊液中AQP4－Ab的陽性檢出率無差異（P＞0.05），而NMO患者血清及腦脊液中 AQP4－Ab的陽性檢出率有差異（P＝0.029，P＝0.001），均在一定程度上顯示出 AQP4－Ab是NMO的特異性抗體，符合上述描寫。

綜上所述，細胞免疫熒光法檢測神經脊髓炎患者的血清及腦脊液中水通道蛋白4抗體的陽性率、敏感性高，適于臨床應用。

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