比較不同抗原修復液對免疫組化結果的影響

王 琦，王一鳴，劉 鐵，郝 苗，叢憲玲，任光旭

（1.延邊大學醫學院，吉林 延吉133000；2.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033；3.延邊大學附屬醫院，吉林 延吉133000）

免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC）是一種通過抗原抗體特異性反應來檢測并定位蛋白的方法，目前廣泛應用于組織病理學診斷［1］。抗原修復是免疫組化實驗中的關鍵步驟，已有文獻針對現有的修復方式做了一個初步的比較，結果顯示微波高壓修復、微波熱修復以及高壓熱修復在相同的條件下具有相似的結果［2］。然而，抗原修復過程中選擇不同的緩沖液，可能對免疫組化結果產生不同的影響。在本文中，我們選擇高壓熱修復方式，研究兩種不同抗原修復液，即檸檬酸緩沖液及Tris－EDTA（TE）緩沖液，對免疫組化結果的影響。

1 材料和方法

1.1 組織

福爾馬林固定石蠟包埋的肺癌組織切片及結腸癌組織切片均來自吉林大學中日聯誼醫院，切片厚度為3μm，每個蠟塊連續切取多張并貼附在商用硅包被的載玻片（世通公司）上，切片吸附后在65℃烤箱中烘烤2h以增強吸附力。

1.2 試劑

MUC1抗體分別購自BD公司（550486）和Abcam公司（ab10120），使用前按適當比例稀釋。免疫組化檢測試劑盒及DAB染液均購自福州邁新生物技術公司。

1.3 修復液

檸檬酸緩沖液（pH 6.0）、TE緩沖液（pH 7.6）。

1.4 免疫組化染色方法

將組織切片脫蠟入水，滴加3%H2O2孵育10 min，水洗，每例切片均經上述兩種不同抗原修復液高壓處理2.5min（排氣后開始計時），之后沖涼水去壓，開蓋后自然冷卻至室溫。修復后按照試劑盒說明書進行操作，最終脫水后進行封片鏡檢。

2 結果

我們分別對肺癌和結腸癌兩類組織切片進行免疫組化染色實驗，每類組織均設有陰性對照、Abcam公司抗體組和BD公司抗體組，每組切片分別進行TE緩沖體系修復和檸檬酸緩沖體系修復。所有切片均由Olympus成像系統拍攝。

2.1 檸檬酸緩沖液vs TE緩沖液，肺癌

在肺癌組織切片中，結果如Fig 1所示，無論采用哪種緩沖體系，陰性對照均背景清晰；比較不同公司兩種抗體的染色結果，我們很容易看出BD公司的抗體染色更強一些。比較兩種不同的緩沖體系，我們發現TE緩沖液進行抗原修復的效果更強，染色更明顯。值得注意的是，Abcam公司的抗體配合檸檬酸緩沖體系的切片染色較淺，很容易被判定為陰性結果。以上結果表明TE緩沖液修復能力比檸檬酸緩沖液修復能力更強。

Fig.1 Immunohistochemistry for lung cancer.（Original magnification×100）

2.2 檸檬酸緩沖液vs TE緩沖液，結腸癌

如Fig 2所示，結腸癌的免疫組化結果與肺癌相似，但是兩種抗原修復液的對比并不十分明顯。所有的抗體染色均較清晰，但是在陰性組可見微弱染色，在可接受范圍之內且與實驗組差別明顯。與TE緩沖液相比，檸檬酸緩沖液抗原修復效果較好，染色較深，背景清晰，特異性顯著，更適合作為結腸癌組織切片的抗原修復液。

Fig.2 Immunohistochemistry for colon cancer.（Original magnification×100）

3 討論

免疫組化是臨床診斷和組織病理學中常用的檢測手段，抗原修復是免疫組化過程中不可忽略的關鍵步驟。主要原因在于免疫組化中常采用的固定液福爾馬林會影響抗原與抗體的識別。福爾馬林的主要成分是甲醛，可用于保存細胞形態，穩定細胞基質，防止細胞發生自噬或蛋白移位［3］。當細胞內被固定液浸潤后，主要的肽段和基本結構都會保存下來。除此之外，一些核苷酸也可能會與福爾馬林發生反應，而碳水化合物則不會有類似現象［4］。福爾馬林中的甲醛可以特定地結合到某些氨基酸殘基上，比如賴氨酸、酪氨酸、組氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺［5］等。其中具體的原理還不清楚，可能是不帶電的氨基基團（－NH或NH2）與甲醛（CH2O）之間形成了亞甲基橋，方程式如下：

在這個反應中，組織上的活性氫首先與甲醛發生反應得到羥甲基，羥甲基再與其他的活性氫發生反應最終得到交聯的蛋白［6］。因為這一過程消耗了氨基中的氫，所以擾亂了氨基酸之間原有的氫鍵和相互作用［7］，使蛋白質的三級或四級結構被破壞從而導致抗原不能很好的被抗體識別［8］。

因此，經過固定的切片由于抗原與甲醛發生交聯，導致蛋白信號被掩蓋。這種交聯在高溫加熱或是蛋白酶水解的作用下會發生可逆反應，恢復蛋白的原有構象，這一過程就是抗原修復［9］。自抗原修復技術發現以來，該過程已經成為免疫組化中必經的一步［10］。據文獻報道，在福爾馬林固定的組織中，大約有85%的抗原經過優化的抗原修復都會得到較好的免疫組化結果［11］。

目前研究者對于抗原修復的具體機理尚不清楚，且抗原修復方式不同，結果也各不相同。在本文中，我們比較了兩種不同的抗原修復液，發現TE緩沖液修復抗原的能力更強，但是同時也提升了暴露內源性過氧化物酶以及脫片的風險。

兩種抗原修復液最大的區別在于pH值不同和是否存在EDTA。pH對抗原修復影響很大，有些抗原可以在較大的pH范圍內進行修復，而有些抗原只能在某一特定的pH值被修復［12］。此外，高pH緩沖液更容易使組織中內源性生物素暴露。因此，在使用SP法進行實驗時，對酶系豐富的組織，如肝、腎等，應優先使用低pH緩沖液進行實驗，如檸檬酸緩沖液。EDTA是一種鈣或其他二價離子的螯合劑，鈣離子可以誘導蛋白構象發生改變最終引起免疫活性的改變［3，13］。由以上可以得出，檸檬酸修復液更適合表位容易暴露的抗原，TE緩沖液更適合信號較弱的抗原。因此，我們建議在抗原修復時，應優先使用檸檬酸鹽緩沖液，若是修復效果不理想，再用TE緩沖液進行嘗試。

此外，本文中我們使用了兩個不同公司針對同一抗原的抗體，但是實驗的結果并不一致，主要原因可能是它們針對的抗原表位不同。而且，在不同的組織中，結果也不十分相同，可能的原因是不同的組織中抗原發生交聯的程度不同。因此，在進行免疫組化實驗時，哪怕是同一種抗原，進行抗原修復的最優方式也可能不同，在實驗前進行預實驗確定最佳實驗條件是必要的步驟。

［1］Goudie RB.Immunomicroscopy：A Diagnostic Tool for the Surgical Pathologist［J］.J ClinPathol，1988，41（2）：237.

［2］Taylor CR，Shi S R，Chen C，et al.Comparative study of antigen retrieval heating methods：microwave，microwave and pressure cooker，autoclave，and steamer［J］.Biotech Histochem，1996，71（5）：263.

［3］Hayat MA.Microscopy，immunohistochemistry，and antigen retrieval methods［M］.New York：Kluwer Academic/Plenum Publishers，2002.

［4］Eltoum，Isam，et al.Introduction to the theory and practice of fixation of tissues［J］.J Histotechnol，2001，24（3）：173.

［5］Shi SR，Gu Jiang，Taylor CR，et al.Development of the antigen retrieval technique：philosophical and theoretical bases［M］.Antigen retrieval techniques：immunohistochemistry and molecular morphology，2000：17.

［6］Dapson，Richard W.Fixation for the 1990＇s：a review of needs and accomplishments［J］.Biotech Histochem，1993，68（2）：75.

［7］Fredenburgh JL，Myers RB：Basic IHC workshop［C］.Long Beach，California：28thAnnual Meeting National Society for Histotechnology，2002.

［8］Montero，Claudio.The antigen－antibody reaction in immunohistochemistry［J］.J HistochemCytochem，2003，51（1）：1.

［9］Fraenkel– Conrat H，Brandon BA，Olcott HS.The reaction of formaldehyde with proteins IV［J］.J BiolChem，1947，168（1）：99.

［10］Shi SR，Key ME，Kalra KL.Antigen retrieval in formalin－fixed，paraffin－embedded tissues：an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections［J］.J HistochemCytochem，1991，39（6）：741.

［11］Ramos－Vara JA，BeissenherzME.Optimization of immunohistochemical methods using two different antigen retrieval methods on formalin－fixed，paraffin－embedded tissues：experience with 63 markers［J］.Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2000，12（4）：307.

［12］Shi，SR，Iman SA，Young L，et al.Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies［J］.J HistochemCytochem，1995，43（2）：193.

［13］Imam，SA，Young L，Chaiwun B，et al.Comparison of two microwave based antigen－retrieval solutions in unmasking epitopes in formalin－fixed tissue for immunostaining［J］.Anticancer Res，1994，15（4）：1153.