急性熱應激對成年期大鼠睪丸蛋白表達譜的早期影響*

高 鑫王曉梅孔曉君劉 新,劉芙君王海燕李建遠-4**

1. 煙臺大學生命科學學院（山東煙臺 264005）; 2. 寧夏醫科大學檢驗學院;

3. 煙臺毓璜頂醫院中心實驗室; 4.國家衛計委科學技術研究所男性生殖健康重點實驗室

急性熱應激對成年期大鼠睪丸蛋白表達譜的早期影響*

高 鑫1王曉梅2孔曉君2劉 新1,3劉芙君3王海燕3李建遠1-4**

1. 煙臺大學生命科學學院（山東煙臺 264005）; 2. 寧夏醫科大學檢驗學院;

3. 煙臺毓璜頂醫院中心實驗室; 4.國家衛計委科學技術研究所男性生殖健康重點實驗室

目的 探索急性熱應激處理成年大鼠睪丸誘發蛋白質表達譜的改變，揭示大鼠早期熱應激響應蛋白。方法 建立大鼠睪丸熱應激動物模型，42℃水浴30min；隨后提取實驗組和對照組睪丸總蛋白， 利用雙向凝膠電泳分離、質譜鑒定大鼠睪丸受熱后差異變化的蛋白；進一步通過生物信息學、Western blot和免疫組化等方法進行深入驗證。 結果 發現差異表達蛋白19個，其中上調蛋白9個，下調10個。這些蛋白功能涉及刺激應答、蛋白水解、總代謝、氧化還原、信號傳導、凋亡等。根據功能分類選取上調蛋白78 kDa glucose-regulated protein（Hspa5），下調蛋白Peroxiredoxin6（Prdx6）、Superoxide dismutase（sod1）、Ubiquitin（Rps27a）、ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1（Uchl1）的Western blot結果與蛋白質組學分析結果一致。 結論 急性熱應激引起大鼠睪丸早期損傷可引發組織內部涉及多種功能生精細胞蛋白表達發生改變。

急性熱應激; 早期損傷; 睪丸蛋白質組學; 應答蛋白

睪丸是重要的雄性生殖腺，可產生精子并合成分泌性激素。由于精子發生時涉及多個連續細胞分裂的過程，使得該過程對熱敏感。目前局部高溫是世界衛生組織公認的對男性生殖能力有影響的因素之一。大多數哺乳動物陰囊內睪丸的溫度比身體核心溫度低2～4℃[1]。這個數值差是保持最佳生殖功能所必備的，陰囊無脂肪組織、密集汗腺、位置處在體腔外、睪丸自身內血管的逆流交換機制都是為了給睪丸提供適宜的溫度環境。熱應激對許多物種最不利的影響是造成無精子癥或少精子癥。已有研究證明高溫能引起哺乳動物睪丸組織形態變化、生精細胞凋亡等，影響生精過程進而造成短暫輕度不育[2-7]。蛋白質組學技術已被用于弱精子癥和精索靜脈曲張等研究的領域，但用于睪丸應答熱應激的蛋白質水平變化鮮有報道。本研究通過蛋白質組學技術篩選熱應激處理的大鼠睪丸中表達變化顯著的蛋白，探索睪丸對熱應激響應的早期蛋白。

材料與方法

一、材料

（一）實驗動物

8周齡雄性SD大鼠12只，購自濱州醫學院動物實驗中心。

（二）主要試劑

B C A蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天（P0011）。Uchl1, Hspa5, Prdx6抗體購自 Santa Cruz（sc-58595、 sc-1051、sc-55015）；sod1抗體購自abcam（ab195505）。辣根酶標記的山羊抗兔IgG和辣根酶標記的山羊抗鼠IgG購自中杉金橋（ZB-2301）。

二、方法

12只大鼠隨機分為兩組（各6只），一組為實驗組，腹腔注射氯胺酮0.8～1mL麻醉后（參考說明書2ml/kg），下半軀浸入設定溫度的電熱恒溫水浴鍋水中30 min，對大鼠睪丸進行熱應激。一組為對照組，進行腹腔麻醉，不進行熱應激。熱應激結束后處死大鼠采集睪丸，一半Bouin氏液固定，用于組織切片觀察，剩余-80℃保存。

（一）蛋白質組學

1. 雙向凝膠電泳：取睪丸組織液氮研磨，蛋白裂解液（7M Urea，2M Thiourea，1%DTT，4%CHAPS，2% IPG buffer，1%cocktail）裂解，測蛋白濃度，利用Ettan IPGphorⅢ等電聚焦系統及其配件進行IEF電泳，實驗組和對照組樣品上樣量均為500μg。在非線性pH3-10的IPG干膠條中進行一維等電聚焦分離：30V，6h；100V，6h；3 000V，2h；10 000V，2h；10 000V，6h。結束后將膠條先后置于DTT平衡液和IAA平衡液中常溫搖床中搖各15min。然后將膠條移至垂直電泳系統，通過12.5% SDSPAGE進行二維分離，電泳條件維持恒定功率（6W/膠）。當溴酚藍指示條帶遷移到膠底部邊緣時結束電泳。再經固定、染色（考馬斯亮藍）、脫色。

2. 凝膠圖譜的采集、分析及質譜檢測：重復三次雙向凝膠電泳，得到的六塊膠使用Image Scanner掃描獲取圖像，利用ImageMaster 2D Flatinum6.0 進行比對，選擇兩組中三塊膠共有的點進行差異比較分析。尋找至少2塊膠相差2倍以上的差異蛋白質點從膠中挖出，脫色2次（50%乙腈，50% 50mM NH4HCO3），30min/次；100%乙腈凝膠，吸出晾干后，加入胰酶（10ng/μL，25mM NH4HCO3），37℃保溫16～18h，超聲10min，將蛋白液點靶。利用MALDI-TOF MS質譜（AB SCIEX 5800系統）分析。

（二） 生物信息學分析

5800質譜儀獲得譜圖通過隨機附帶的proteinpilot軟件進行分析，查詢Swiss-prot數據庫尋找匹配的蛋白，選擇蛋白分值大于50、蛋白分值可信度P＞95%的差異蛋白。使用Protein Information Resource數據庫檢索出差異蛋白的功能、所參與的生物學進程。

（三） Western 印跡分析

裂解液提蛋白樣品，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度；12.5% SDS-PAGE電泳分離；電轉到硝酸纖維素膜；5%脫脂奶粉封閉1h；分別加入兔抗Hspa5 1:1 000稀釋、兔抗Uchl1 1:500稀釋、兔抗sod1 1:1 000稀釋、兔抗Prdx6 1:1 000稀釋，鼠抗β-actin 1:2 000稀釋。4℃搖床過夜；TBST洗3次，10min/次，搖床上進行；分別加入對應的二抗: 辣根酶標記的山羊抗兔IgG、辣根酶標記的山羊抗鼠IgG，稀釋度1:5 000，搖床2h，洗滌3次；顯影。掃描后圖像用ImageJ軟件分析灰度值。

（四） 統計分析

結 果

一、熱應激對大鼠睪丸蛋白的影響

熱應激實驗組于對照組大鼠睪丸樣本雙向凝膠電泳重復3次，掃描后選擇較好的組進行匹配。發現蛋白凝膠圖譜中蛋白質點的匹配性好如圖1，蛋白質點分子量主要分布于15～120KDa，pI分布于3～10。實驗組與對照組匹配出432點，ImageMaster 2D Flatinum得出實驗組與對照組中表達具有顯著性差異的點有65個。經質譜分析，去除重復，最終確定變化蛋白有19個。其中表達量上升的蛋白質點有9個，下降的有10個，蛋白質點編號、名稱及功能如表1。

表1 熱應激致使大鼠睪丸差異表達蛋白質點質譜鑒定結果

圖1 熱應激處理前后睪丸組織蛋白質雙向電泳的對比圖

二、生物信息學結果

Protein Information Resource數據庫檢索出差異蛋白的功能分類見圖2，涉及凋亡、抗氧化、應激功能的蛋白共占有一定比例，是睪丸內各生物學進程中重要的參與者，其中Prdx6、sod1屬于抗氧化功能蛋白，Hspa5是與應激相關的蛋白，Uchl1是與凋亡有關的蛋白，因此對它們進行進一步的研究。

圖2 大鼠睪丸細胞中質譜檢測出差異明顯的20個蛋白的功能分類

三、Western Blot驗證熱應激對睪丸蛋白的影響

Prdx6、Hspa5、Sod1、Uchl1蛋白經Western Blot驗證，與蛋白質組學結果均一致，相對于對照組Prdx6、sod1、Uchl1表達下調（P＜0.05）。Hspa5表達上調（P＜0.05），如圖3。目的條帶顯示Uchl1分子量27KD，Hspa5分子量78KD，Prdx6分子量25KD，sod1分子量16KD。

討 論

熱應激反應是指動物受到超過本體體溫調節能力的高溫刺激時，機體產生的非特異性應答反應。睪丸作為重要的雄性生殖腺，在熱應激的狀態下，其形態和功能都受到影響。已有研究表明熱應激造成兔、小鼠等哺乳動物睪丸質量下降、睪丸組織有形態學變化，受精能力下降，溫度依賴的精細胞死亡以及復雜的應激反應，比如SOD水平下降出現氧化應激反應[8]。但少有研究利用蛋白質組學技術檢測熱應激后睪丸中不同蛋白質的變化，本研究所建的熱應激模型所反應的是熱應激所產生的早期損傷，利用蛋白質組學技術檢測到的變化蛋白中，具有抗氧化功能的蛋白Prdx6和SOD1下調，即抗氧化酶活性降低清除自由基能力下降，進而會對睪丸組織造成進一步影響，與已有研究一致[8-10]。同時也有研究闡述熱應激導致生精細胞凋亡，造成生精障礙進而影響生殖能力[11,12]。本研究驗證了此觀點并證明熱應激產生的早期損傷就已經涉及生精細胞凋亡。 本研究所得出的差異表達蛋白，與抗氧化、應激和凋亡相關蛋白占到35%，說明這三類蛋白在熱應激反應中發揮重要作用，分別以過氧化物酶6，超氧化物歧化酶；熱休克蛋白5；泛素羧基末端水解酶L1前體酶為代表。從氧化損傷、內質網應激相關應答以及泛素相關體系方面進行討論，推斷熱應激引發生精細胞凋亡的機制。

圖3 42℃水浴30min后大鼠睪丸對照組與應激組Uchl1、Sod1、Prdx6、Hspa5蛋白 Western Blot分析

一、抗氧化相關蛋白表達下調

過氧化物酶6（Peroxiredoxin6，Prdx6）是非硒依賴過氧化物酶家族蛋白的一員。在大鼠睪丸中，Prdx6表達在于睪丸支持細胞中[9]。細胞中Prdx6位于細胞質、溶酶體或者細胞質囊泡，主要參與細胞的氧化還原調控，在磷脂顛倒和保護細胞對抗氧化損傷的調控中扮演重要角色。Prdx6和Gstm3是有機體對抗氧化應激損傷的兩個重要蛋白[10]。本研究中急性熱應激初期Prdx6下調或許是造成生精細胞凋亡的原因。

超氧化物歧化酶（sod1），即CuZn-SOD，是一種廣泛存在于真核生物的金屬酶，催化超氧陰離子轉化為H2O2和O2，存在于細胞質，也存在于線粒體內外膜之間。清除氧自由基，對抗氧化損傷，在免疫系統中也有重要的作用。熱應激會使體內茶酚胺類物質分泌增加，使得機體組織處于缺氧狀態，產生過多的自由基，SOD水平下降，會使得過多的自由基不能及時清除，引起脂質過氧化破壞生物膜，脂質過氧化呈鏈式反應，一旦引發會持續進行使得自由基反應擴增放大,對細胞造成極大損傷[11]。Lue等[12]從基因水平研究熱應激作用與睪丸后的研究中，CuZn-SOD下調，本實驗結果為蛋白水平方面的結果與基因水平結果一致。

二、應激相關蛋白表達上調

熱休克蛋白5（Hspa5）是結構功能了解比較清楚的HSP70家族的成員，即位于內質網的葡萄糖調節蛋白78（glucose regulated protein in 78KD, GRP78），又稱免疫球蛋白重鏈結合蛋白，是重要的內質網分子伴侶，其功能表現在啟動內質網應激相關性細胞凋亡。存在于胞漿的Caspases半胱天冬蛋白酶包括Caspase3、7、8、9、12等，有裂解蛋白的功能，其中Caspase12在正常狀態下與GRP78形成復合體滯留在內質網表面，此時Caspase12表現為無活性狀態。內質網應激條件下，復合體解離，形成游離的Caspase12，游離的Caspase12直接激活Caspase9，Caspase3受到Caspase9的活化以及接下來的一系列級聯反應最終將導致細胞凋亡[13]。故推測本研究Hspa5表現為上調有限制細胞凋亡的作用。Shi等研究也表明在涉及內質網應激應答中的未折疊蛋白反應過程Hspa5表達上調[14]。

三、凋亡相關蛋白表達下調

泛素羧基末端水解酶L1前體酶（Uchl1），位于細胞質、內質網膜或者脂錨，參與泛素前體和泛素化蛋白進程。通過泛素蛋白酶體途徑（UPP）參與凋亡和細胞信號轉導。Uchl1在睪丸和附睪中高表達并在精子發生和精子質量的調節方面起重要作用。缺乏Uchl1的小鼠在精子產量、形態學和運動性方面都存在缺陷[15]，附睪泛素水平降低、對抗隱睪癥相關的精子凋亡變弱。Uchl1的功能表現在精子發生的早期凋亡波和精子成熟時精子質量的控制[16]。Hua 等研究也表明Uchl1的下調與凋亡有關[10]，也認為熱應激后Uchl1的下調可能抑制睪丸生精細胞凋亡。

本研究通過對結果的廣泛研究分析認為，首先熱應激對生殖的影響表現為Prdx6、Sod1的下調使得細胞抗氧化機能下降，睪丸細胞線粒體功能受損，進而影響生精細胞及精細胞的凋亡。雖然Hspa5的上調和Uchl1的下調也許會抑制精細胞的凋亡，但會引起細胞增殖和凋亡的不平衡，影響男生殖器官發育的調控；其次Uchl1的表達下調會妨礙泛素-蛋白水解途徑并造成睪丸細胞中大量需要降解的蛋白堆積，損害睪丸功能。泛素-蛋白水解途徑在線粒體介導的細胞凋亡中頗為重要[17]，因此熱應激造成生精細胞凋亡的機制可能是妨礙泛素-蛋白水解體系以及線粒體介導的細胞凋亡。

綜上所述，本研究通過蛋白質組學技術，對比熱應激與正常睪丸組織的蛋白差異，根據其功能探索它們與熱應激早期損傷的關系。42℃條件的熱應激30min立即取樣，蛋白質組學揭示差異蛋白中有具有抗氧化、蛋白水解、凋亡功能的蛋白。選取變化的Prdx6、Hspa5、sod1、Uchl1蛋白，進一步研究發現它們參與氧化應激反應和凋亡的調控。結合這些蛋白的定位以及其在其他組織中的功能，本研究結果表明氧化損傷和異常的凋亡調節是熱應激造成生殖損害的原因，破壞泛素-蛋白水解體系以及線粒體介導的細胞凋亡是生精細胞凋亡的可能機制之一。進一步確定四種蛋白誰是熱應激作用于睪丸組織的分子靶標還需進一步研究探索。

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（2015-03-20收稿）

Early effects of acute heat stress on the protein expressions in the adult rat testis＊

Gao Xin1, Wang Xiaomei2, Kong Xiaojun2, Liu Xin1,3, Liu Fujun3, Wang Haiyan3, Li Jianyuan1-4**
1. College of Life Science, Yantai University, Yantai 264005, Shandong, China; 2.Department of Laboratory Medicine, Ningxia Medical University;
3.Central Laboratory, Yantai Yu-Huang-Ding Hospital; 4. National Research Institute for Family Planning Corresponding author: Li Jianyuan, E-mail: sdscli@126.com

Objective To compare the proteomic alterations between the acute heat-shocked testis and the normal ones for discovering the responsive proteins in the adult rat testis. Methods Heat-shocked testicular model was established by immersed in a water bath at 42℃ for 30 minutes. Extracted total testicular protein from the heat-shocked group and normal group were analyzed by two-dimensional gel electrophoresis analyses and mass spectrometry. Bioinformatics disclosed GO classifcation of the differential proteins, which were also confrmed by western blotting. Results 19 proteins have signifcantly changed their expressions, including 9 up-regulated proteins, and 10 down-regulated ones. These proteins were involved in stimulus response, protein hydrolysis, oxidation and reduction, total metabolism, signal transduction, apoptosis. According to their functions, up-regulated 78 kDa glucose-regulated protein (Hspa5), and down-regulated Peroxiredoxin6 (Prdx6), Superoxide dismutase (SOD1), Ubiquitin (Rps27a), ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1 (Uchl1) were further verifed by western blot. Their results were consistent with proteomic analysis. Conclusion The early damage of the adult rat testis induced by heat stress indeed caused the signifcant changes in the protein expressions, and those proteins were involved in various functions responding to the heat shock.

acute heat stress; early damage; testicular proteome; responsive protein

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.05.002

R 697. 22

資助: 國家自然科學基金（81300533, 8137001）; 山東省自然科學基金（ZR2013HQ002, ZR2014HQ068）**通訊作者, E-mail: sdscli@126.com