成年山羊附睪不同區段精子與凝集素芯片結合的差異研究*

辛愛潔吳延成程 莉刁 華

顧一驊3吳 斌3陶生策2施惠娟3張永蓮1,3,4**

1. 華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室（上海 200237）;

2. 上海交通大學系統生物醫學研究院; 3. 國家人口和計劃生育委員會計劃生育藥具重點實驗室，上海市計劃生育科學研究所; 4. 中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所

1. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China;

2.Department of Reproductive Pharmacology, NPFPC Key Laboratory of Contraceptives and Devices, Shanghai Institute of Planned Parenthood Research; 3.Shanghai Center for Systems Biomedicine, Shanghai Jiao Tong University; 4.Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences Corresponding author: Zhang Yonglian, E-mail: ylzhang@sibs.ac.cn

·論 著·

成年山羊附睪不同區段精子與凝集素芯片結合的差異研究*

辛愛潔1吳延成1程 莉2刁 華3

顧一驊3吳 斌3陶生策2施惠娟3張永蓮1,3,4**

1. 華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室（上海 200237）;

2. 上海交通大學系統生物醫學研究院; 3. 國家人口和計劃生育委員會計劃生育藥具重點實驗室，上海市計劃生育科學研究所; 4. 中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所

目的 研究成年山羊精子在附睪成熟過程中與凝集素芯片結合的差異。方法 精子分別取自成年山羊附睪頭、體、尾部，經2%多聚甲醛/0.2%戊二醛固定后，然后進行碘化丙啶染色標記，再分別與含有91種凝集素的芯片結合。信號經提取后，利用SPSS16.0和R語言對其進行后續分析和比較。結果 山羊附睪頭、體、尾各部分精子與含各類型糖基特異性的凝集素芯片結合分析后發現，與山羊附睪頭部精子結合的凝集素有40種，體部精子結合的有48種，尾部精子結合的有42種。來自附睪不同區段的精子與凝集素結合強度也有顯著差異，其中，甘露糖特異性的凝集素與體部精子結合最高，復雜結構特異性的凝集素與附睪頭、體、尾各部分精子的結合強度呈梯度下降趨勢。結論 山羊精子膜表面的糖被，隨著精子在附睪中的成熟，也在不斷地發生變化的。

山羊; 附睪; 精子

中文分類號Q 956

1. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China;

2.Department of Reproductive Pharmacology, NPFPC Key Laboratory of Contraceptives and Devices, Shanghai Institute of Planned Parenthood Research; 3.Shanghai Center for Systems Biomedicine, Shanghai Jiao Tong University; 4.Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences Corresponding author: Zhang Yonglian, E-mail: ylzhang@sibs.ac.cn

附睪是雄性生殖系統中的重要器官，從組織解剖學上大致分為附睪頭（Caput）、體（Corpus）、尾（Cauda）三部分。一般，附睪頭部和體部主要發揮分泌和吸收的功能，而附睪尾部主要是為精子提供儲存的場所，幫助精子射出。

睪丸生成的精子，在通過附睪頭部轉運到附睪尾部的過程中，不斷成熟，最終獲得運動能力以及受精能力[1]。精子在附睪內成熟過程中，其膜結構會發生有序變化，包括膜脂、膜蛋白、膜表面糖基成分、膜電荷以及膜流動性與通透性變化[2,3]。其中各種糖基化修飾的蛋白或脂質結合到精子膜表面，在精子膜表面形成20 nm～60 nm厚的糖被[4]。與僅有三種糖蛋白組成的卵子透明帶相比，精子糖被的組成成分要復雜的多，其大約由三百多種不同的糖蛋白和糖脂組成。精子糖被是雄性配子與外界環境相互作用的主要界面[5,6]，在精子形成、成熟、獲能以及頂體反應過程中，精子表面糖蛋白發生巨大重排，精子糖被的微妙變化對精子生育力具有重大影響，精子糖被的成熟與精子生育力緊密相關[7-9]。

目前用于研究細胞膜表面糖基組成和結構的技術主要為質譜，此項技術已經成功用于分析細胞表面的糖基[10-12]，但是膜表面糖鏈的分離和富集比較困難，從而限制了質譜的應用范圍。而作為一類天然存在的，能夠特異性識別糖基的凝集素，已被廣泛用于研究精子糖基[13-16]。一般用生物素、熒光素等對凝集素進行標記，然后通過免疫組化、免疫熒光、流式細胞儀等技術檢測其與精子的結合情況。但這些方法不僅費時費力，還無法進行高通量檢測。最近幾年發展起來的凝集素芯片技術則可以高通量、高效率地檢測復雜混合物的糖組分，目前已經應用到各種細胞中，包括細菌[17,18]、真菌[19,20]、病毒[21]以及哺乳動物細胞[22,23]。我們實驗室通過實驗條件的優化，也已成功將凝集素芯片技術應用到來自不同物種的成熟精子細胞中[24]。

精子在附睪成熟過程中，其細胞表面的糖被發生了哪些有趣的變化？本文將利用高通量的凝集素芯片技術，對成年山羊附睪頭、體、尾各區段的精子與凝集素芯片的結合情況進行分析比較。

材料與方法

一、動物

新鮮的附睪組織取自成年關中山羊，由上海轉基因研究中心贈予。

二、精子樣本分離和制備

新鮮山羊附睪經剔除脂肪組織后，分為附睪頭、體、尾三部分，分別置于30 mL PBS中，用剪刀把各部分組織剪成小塊，置于37℃孵育20min，讓精子自然游出，小心吸取含有精子的上清，經1000×g離心10min，收集管底的精子。經PBS洗滌兩次后，用2%多聚甲醛/0.2%戊二醛固定30min，再用PBS洗滌兩次，加入5 mL含有0.02%疊氮鈉的PBS重懸精子，置于4℃冰箱儲存待用。

三、凝集素芯片制備

凝集素芯片的制備參考已發表的文獻[22]，并進行了優化。把91種不同凝集素按2 μg/μL定量；然后按照1:1的比例與50%甘油混合，凝集素最終點樣濃度為1 μg/μL；控制點樣室濕度為40%，按照16×18的點樣矩陣方式把凝集素點到平衡好的PSH-OP基片上，置于4℃載物臺上過夜，固定點制的凝集素；次日，芯片裝在芯片盒中，用封口膜封實盒蓋，置于4℃保存待用。

四、精子與凝集素芯片結合

方法參考我們已發表的文獻報道[22,24]。首先凝集素芯片在室溫下平衡30min，然后置于含有0.5% Tween-20的TBST中，輕輕搖晃，室溫封閉60min；凝集素芯片先用PBST清洗1次，再用PBS清洗2次，每次10min；將已標記了矩陣排列位置的普通載玻片放置于芯片背面，然后將12框圍欄以此為模板黏貼在芯片風干的凝集素芯片上，形成12個檢測窗。

在凝集素芯片封閉和洗滌的過程中，同時進行精子的熒光標記。精子與20 μg/mL碘化丙啶（PI）室溫孵育20min后，離心（2 000×g，10min）收集精子；然后用凝集素芯片結合緩沖液（1×PBS，50 μM CaCl2，50 μM MnCl2）重懸精子，按照每個檢測窗加入0.5×107個精子細胞，輕輕地加到每個檢測窗內，放置于濕盒中，室溫避光孵育1h；最后，凝集素芯片在PBST（0.5% Tween-20）中，經翻轉洗滌至清晰看到精子結合的譜系；經室溫避光陰干后，利用GenePix 2000A 芯片掃描儀（GenePix公司），設定532 nm通道，進行信號掃描。

五、數據分析

數據通過GenePix pro 6.0從凝集素芯片掃描圖像上提取，信噪比（S/B）定義為熒光信號平均值/背景熒光信號平均值，即F532 Mean/B532 Mean。芯片上每個凝集素點的S/B經過歸一化處理后，然后對每個樣本重復點的S/B進行平均。數據采用SPSS16.0軟件進行分析處理，顯示為每個凝集素的平均值（Mean）±標準誤差（SEM）。

對S/B≥2的陽性結合凝集素，利用R語言R- 3.0.1（ http://www.r-pro ject.org/）建立了維恩圖以及層次聚類熱圖，并利用歐氏距離對凝集素以及附睪不同區段進行了聚類分析。綠色代表凝集素和精子的強結合信號，紅色代表弱結合信號。

結 果

一、附睪不同區段精子的凝集素結合譜及其差異

為了研究山羊精子在附睪成熟過程中其表面糖被的變化情況，我們把羊附睪分為附睪頭、體、尾三部分，取各部分的精子分別與凝集素芯片結合。經分析，在91種凝集素中，山羊附睪頭、體、尾各部分精子分別與40種、48種和42種凝集素結合（圖1）。這些凝集素的糖基識別范圍廣泛，包含半乳糖（Gal）、N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）、N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）、甘露糖/葡萄糖（Man/Glc）、唾液酸（Sia）、海藻糖（Fuc）、復雜類型，甚至未知的糖基類型。

圖1 成年山羊附睪不同區段精子的凝集素結合譜

山羊附睪頭、體、尾各部分精子與凝集素結合數量都有所不同。按凝集素的不同特異性種類分析，其中，與Gal特異性凝集素相結合的，附睪頭部精子有10個（AIA、GHA、GSL I、GSL I-B4、Jacalin、MNA-G、MPL、RCA I、BPL和MAL I），而體部和尾部精子，除此之外，還與ABA和ACL相結合；與GalNAc特異性凝集素相結合的，頭部精子和尾部精子則相同，都有11個（BDA、CSA、DBA、GS-IA4、HPA、PTL I、SBA、SJA、UDA、VVL和WFA），而體部精子不和其中的PTL I結合，而與Black bean crude結合；與GlcNAc特異性凝集素結合的，頭部和體部精子相同，都有4個（DSL、GSL II、LEL和STL），而尾部精子還與HAA結合；與Man/Glc特異性凝集素結合的，頭部精子和尾部一致，共有5個（ConA Succinyl、LCA、LcH、MNA-M和PSA），而體部精子則還與另外5個凝集素結合（CALSEPA、CPA、 GNL、LcH B和VVA mannose）；與Sia特異性凝集素結合的，體部和頭部有4個（MAA、MAL II、SNA和SNA-I），而尾部精子僅與其中3個凝集素（MAA、MAL II和SNA-I）結合；與Fuc特異性凝集素結合的，體部精子有2個（AAL和LAL），而尾部精子和頭部精子只與AAL結合；與復雜結構以及未知結構糖基特異性凝集素結合的，頭、體、尾三部分的精子則呈現的完全一致，共有5個凝集素（PHA-E、PHA-E+L、PHA-L、MIA和PHA-P）。

山羊附睪頭、體、尾各部分精子與凝集素的結合強度也發生著不同程度的變化。附睪頭部精子與復雜糖基特異性的凝集素結合強度最高，并且沿著頭、體、尾各區段呈下降趨勢；體部精子與Man/Glc特異性凝集素的結合信號，比頭部和尾部均有增強；尾部精子與大部分Gal和GalNAc特異性凝集素的結合強度比頭部和體部精子明顯升高。

二、附睪不同區段精子與凝集素結合譜的聚類分析

為了更為直觀地比較附睪不同區段精子的凝集素結合譜的變化，我們利用R語言建立了維恩圖（圖2）以及熱圖（圖3）。從維恩圖中，我們可以明顯看出，附睪頭、體、尾精子共同結合的凝集素占大部分，有38種（AIA、GHA、GSL I、GSL I-B4、Jacalin、MNA-G、MPL、RCA I、BPL、MAL I、BDA、CSA、DBA、GS-IA4、HPA、SBA、SJA、UDA、VVL、WFA、DSL、GSL II、LEL、STL、ConA Succinyl、LCA、LcH、MNA-M、PSA、MAA、MAL II、SNA-I、AAL、PHA-E、PHAE+L、PHA-L、MIA和PHA-P）；在此基礎上，與體部精子特異性結合的凝集素增加了7個（Black bean crude、CALSEPA、CPA、GNL、LcH B、VVA mannose和LAL），與尾部精子特異性結合的凝集素僅增加1個（HAA）。

從聚類熱圖中，我們可以看到與附睪頭、體、尾各區段精子都具有較強結合的凝集素（圖3，綠色）有12個（LEE、MNA-M、STL、GSL I、SBA、MAA、MALII、SNA-I、HPA、GHA、WFA和VVL），與其它凝集素大部分呈中等強度或弱結合。此外，通過聚類分析發現，與附睪頭部精子結合的凝集素與體部精子較為一致。

圖2 山羊附睪不同區段精子與凝集素結合譜的相關性分析

圖3 山羊附睪不同區段精子與凝集素芯片結合的聚類分析

討 論

糖基化修飾是精子在通過附睪成熟過程中發生的重要事件之一，精子表面含有大量的糖蛋白、糖脂等，從而組成精子糖被[4,25]。精子糖被的成熟是精子在附睪中成熟的特征之一，在保護精子穿過宮頸黏液，黏附到輸卵管上皮細胞，調節獲能，以及精卵識別和結合過程中都起著重要作用[26]。凝集素芯片技術可以高通量、高效率地檢測復雜混合物的糖組分，我們已經成功把此技術應用到精子細胞[24]。本文利用我們前期報道的含有91種凝集素的新型凝集素芯片技術[22]，系統研究了山羊附睪頭、體、尾各區段精子與凝集素芯片的結合情況，發現三個區段的精子分別與40種、48種和42種凝集素結合，并且這些凝集素所識別糖基類型廣泛（圖1），這進一步說明了精子質膜表面的糖蛋白、糖脂類型豐富，并且不同區段精子的糖基修飾類型以及糖基含量也是在不斷變化的。

本文報道的山羊附睪不同區段精子的凝集素結合譜中，特異性識別半乳糖（Gal）的紫荊花菊凝集素（Bauhinia purpurea lectin，BPL）和桑橙凝集素（Maclura pomifera lectin，MPL）、特異性識別N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）的雙花扁豆凝集素（Dolichos bifows agglutinin，DBA）和大豆凝集素（Soybean agglutinin，SBA）、以及一般用來鑒定精子頂體反應狀態的特異性識別甘露糖（Man）的豌豆凝集素（Pisum sativum agglutinin, PSA），都與精子有不同強度的結合，這與以前文獻報道一致[27]，同時也說明了凝集素芯片檢測山羊附睪不同區段精子的凝集素結合譜的可靠性。此外，我們還發現了許多新的與山羊精子結合的凝集素，例如，與附睪頭、體、尾精子都強結合的LEL、MNA-M、STL、GSL I、HPA、GHA、WFA和VVL，以及中等強度結合的SJA、MIA、UDA等，這為后續進一步研究山羊精子在附睪成熟過程中的糖蛋白和糖脂變化打下了堅實基礎。

精子從離開睪丸進入附睪頭部開始，就失去了自身的合成功能，其質膜成分的變化大都是通過與附睪管腔液中的成分相互作用而產生的[28]。精子在通過附睪成熟過程中，其質膜表面糖復合物（包括糖蛋白和糖脂）的糖鏈與附睪液中糖基轉移酶和糖苷酶相互作用，從而添加或去除各種糖基，促進精子糖被成熟[29,30]。精子表面的糖蛋白根據修飾位點不同，分為兩種類型，一種是氮連接的糖基化，也叫N-糖基化（N-linked glycosylation），是以天冬酰胺的酰胺基、N-末端氨基酸的α-氨基以及賴氨酸或精氨酸的ω-氨基為連接點；另一種是氧連接的糖基化，也叫O-糖基化（O-linked glycosylation），是以絲氨酸、蘇氨酸、羥賴氨酸和羥脯氨酸的羥基為連接點。其中，N-型糖蛋白含有較多甘露糖或者復雜結構的糖基，從我們的結果可以看到（圖1），山羊附睪不同區段的精子與甘露糖特異性的凝集素結合信號都有較好的結合（ConA Succinyl、LCA、LcH、MNA-M和PSA），而體部精子的結合強度尤為高，可能由于體部精子和附睪體部管腔液相互作用，一方面增多了精子表面的N-型糖蛋白，另一方面可能通過甘露糖轉移酶增加了精子表面糖蛋白的甘露糖修飾。此外，山羊精子與復雜結構糖基特異性的凝集素也有較強結合（PHA-E、PHA-L和PHA-E+L），并沿著附睪頭、體、尾呈現梯度降低的趨勢，這說明含有復雜結構的N-型糖蛋白或者復雜類型的糖基修飾在精子沿著附睪頭、體、尾成熟過程中不斷減少。而在O-型糖蛋白中，一般不含有甘露糖修飾，第一個結合在絲氨酸/蘇氨酸上的糖基是N-GalNAc，然后再加入各種類型的糖基，我們的結果中（圖1），山羊精子與許多N-GalNAc特異性的凝集素結合，同時也與Gal、GlcNAc、Sia、Fuc，甚至一些未知特異性的凝集素具有較強的結合，這說明山羊附睪頭、體、尾各區段精子表面也都富含有O-型糖蛋白。這與其它動物的精子表面糖蛋白類似[25]。

本文對附睪精子成熟過程的表面凝集素結合譜及其變化的闡明，為研究精子表面糖譜打下了堅實的基礎，將有利于我們進一步研究精子的成熟過程，以及精卵識別和結合的相互作用機理。

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（2015-03-08收稿）

Different lectin expression analysis of sperms from different epididymal segments of adult goat using lectin microarray

Xin Aijie1, Wu Yancheng1, Cheng Li2, Diao Hua3,
Gu Yihua3, Wu Bin3, Tao Shengce2, Shi Huijuan3, Zhang Yonglian1,3,4**

Objective To study the differences of lectin expression in adult goat sperm using lectin mciroarray during epididymal maturation. Methods Goat sperms were separated from epididymal caput, corpus and cauda, and then fxed with 2% paraformaldehyde containing 0.2% glutaraldehyde and labled with propidine iodide, subsequently they were incubated with lectin microarray. The lectin binding signals of the sperm were extracted and analyzed by SPSS16.0 and R Programming Language. Results There were 40 lectins binding with sperm from goat epididymal caput, 48 lectins binding with corpus sperm and 42 lectins binding with cauda sperm. In addition, the signal intensity of sperm from different epididymal segments also had signifcant difference. The signal value of mannose specifc lectins binding with the corpus sperm were highest, and that of complex structure specifc lectins binding with sperm from caput, corpus and cauda was gradient descent. Conclusion The glycocalyx of goat sperm are constantly changing during transiting epididymis.

goats; epididymis; spermatozoa

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.05.001

資助: 國家青年科學基金項目（81401252）**通訊作者, E-mail: ylzhang@sibs.ac.cn