蛋白激酶SGK3基因的克隆及其在乳腺癌細胞中的表達

郭紅艷 孫曉杰 李淑艷 劉秀財 劉 波 王宏蘭 蔣瑞雪

(齊齊哈爾醫學院生物化學教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

蛋白激酶(SGK)可能作為多種細胞信號轉導通路和細胞磷酸化級聯反應的一個功能性交匯點，通過作用于下游底物參與信號通路和細胞應答反應的調節，并且在腫瘤的形成、腫瘤細胞浸潤或遷移及惡性轉化過程中起到重要的作用〔1，2〕。N-端增強型綠色熒光蛋白(pEGFP-N1)具有復制能力強、檢出率高、無細胞毒性、易于構建融合蛋白等特點，是常用的表達載體。本實驗利用DNA重組技術方法構建pEGFP-N1-SGK3重組質粒，為SGK3與腫瘤發生發展的相關性后續研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和質粒 乳腺癌細胞株MCF-7由中國醫學科學院腫瘤研究所提供，細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液在37℃、5%CO2條件下培養。本研究所用pAcG-4T3-SKG3質粒由美國霍普金斯大學醫學院夏獻民博士惠贈，pAcG-4T3-SKG3質粒含有人SGK3 cDNA基因，全長為1.3 kb，含BamH I和Xho I酶切位點。

1.1.2 主要試劑和抗體 RPMI1640細胞培養基(Gibco)、新生牛血清(PAA)、胰酶(DIFCO)購買于Invitrogen(USA)公司;細胞培養瓶、培養板購自英國Nunc公司;BamH I和Xho I購自寶生物工程有限公司;anti-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、anti-SGK3、購自美國CST公司，二抗購自美國SANTA CRUZ公司，本研究所用引物由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR獲取目的基因 提取pAcG-4T3-SKG3質粒，根據SGK3和pEGFP-N1載體的序列，選擇XhoⅠ和BamH I酶切位點，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物，通過聚合酶鏈反應(PCR)方法從pAcG-4T3-SKG3質粒中擴增目的基因，SGK3正義序列:5'CCGCTCGAGACCATGGCCCTGAAGATTC3'，反義序列:5'CGCGGATCCAAAAATAAGTCTTCTG 3'。PCR反應條件:95℃ 預變性10 min，95℃變性 45 s，50℃ 退火 45 s，72℃ 延伸80 s，循環30 次，72℃，10 min，4℃ 保存。PCR 產物進行 1.0%瓊脂糖凝膠電泳，回收SGK3基因片段。

1.2.2 pEGFP-N1-SGK3重組質粒的構建 純化后的PCR產物經限制性內切酶XhoⅠ和BamH I雙酶切后與同樣酶切的載體pEGFP-N1進行連接，連接產物轉化至大腸桿菌(DH5α)感受態菌中，繼而將其轉移到含Kanamycin的LB瓊脂培養基上，觀察菌落生長情況;挑菌進行菌落PCR，提取質粒，進行雙酶切鑒定，陽性菌株送至上海invitrogen公司進行測序，測序結果與Genbank源基因用軟件網絡ClustalW進行基因比對，將鑒定后的重組質粒命名為pEGFP-N1-SGK3。

1.2.3 基因轉染 采用GenEscortTMⅠ 進行細胞轉染，生長良好的MCF-7細胞于轉染前24 h接種到6孔板中，待細胞總面積達到60% ～80%，取3 μg pEGFP-N1-SGK3質粒進行基因轉染，同時轉染pEGFP-N1空載體作為對照(具體操作按說明書進行)。在轉染后48 h，在熒光顯微鏡下觀察pEGFP-N1表達情況，確定轉染效率。

1.2.4 Western印跡檢測融合蛋白表達 收集各組細胞，提取細胞總蛋白并測定細胞總蛋白濃度。取50 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉膜，將硝酸纖維素(NC)膜用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，按1∶1000稀釋一抗，4℃孵育過夜，洗膜后，加入1∶5000的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗室溫孵育2 h，用Tris鹽酸緩沖液(TBST)室溫漂洗后顯影，采用化學發光法(ECL)曝光膠片，沖洗顯色檢測相應的蛋白條帶，GPS8000型凝膠成像分析系統掃描分析蛋白條帶。

2 結果

2.1 重組表達載體菌落PCR 平板菌落密集，圓形，稍凸起，大小中等，分布均勻，邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、光滑，呈乳白色。為初步確定重組質粒構建結果，挑4～6個單菌落進行PCR，產物序列大小與目標條帶一致。見圖1。

圖1 重組表達載體菌落PCR

2.2 重組質粒pEGFP-N1-SGK3的酶切鑒定 重組質粒pEGFP-N1-SGK3經XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果可見約1.3 kb的DNA帶，表明所獲SGK3酶切片段的大小與預期相符。見圖2。

2.3 測序鑒定轉化菌 對轉化菌的質粒進行DNA測序，測序結果表明，所選送測序的重組表達載體堿基序列完全正確，見圖3。

圖2 重組質料pEGFP-N1-SGK3的酶切鑒定

圖3 測序結果

2.4 轉染效果評價 轉染后48 h后倒置熒光顯微鏡觀察，視野內有較強的綠色熒光，即證明有綠色熒光蛋白GFP的表達。說明各表達載體成功轉染入乳腺癌mCF-7細胞中。見圖4。

圖4 轉染效果評價

2.5 轉染細胞中SGK3蛋白表達的鑒定 重組質粒pEGFPN1-SGK3和空載體質粒pEGFP-N1分別轉染MCF7后，通過Western印跡方法用抗GFP的抗體對轉染細胞中融合蛋白SGK3-GFP的表達進行檢測，結果發現SGK3在MCF-7細胞中能夠表達，且融合蛋白SGK3-GFP的表達量(0.7081±0.0595)略高于空載體中GFP的表達量(0.5847±0.0251)。見圖5。

圖5 Westem印跡法檢測轉染細胞中融合蛋白SGK3-GFP的表達

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，目前該病被認為是影響女性身心健康乃至危及生命的殺手之一〔3〕，現代免疫學、分子生物學技術得以迅速發展，人類對乳腺癌發病機制研究不斷深入，多種乳腺癌相關基因被陸續發現并進行廣泛研究，基因靶向治療逐漸成為乳腺癌生物學治療中的重要部分〔4〕。

通過磷酸蛋白組學篩選和功能基因組研究發現，許多腫瘤細胞系表現出SGK3的依賴性〔1〕。在前列腺癌、卵巢癌和肝癌中等多種腫瘤中都發現了SGK3的表達與正常組織有較大差異。已有證據提示SGK3可作為某些腫瘤的預后標志物和用于治療腫瘤的新目標〔5〕。對該基因與乳腺癌的發生發展的相關性研究國內外至今鮮有報道。本實驗測序結果表明，成功構建真核表達載體pEGFP-N1-SGK3，經多次轉染條件的摸索，利用高效GenEscortTMI基因轉染試劑將SGK3轉染MCF-7人乳腺癌細胞，使之轉染MCF7細胞后48 h轉染效率達70%以上，Western印跡方法檢測證實，目的基因在乳腺癌細胞中能夠有效地表達。上述研究為進一步研究SGK3與乳腺癌發生發展的關系及其對乳腺癌的惡性行為的影響極其機制研究等后續工作打下了基礎。

1 Wang Y，Zhou D，Phung S，et al.SGK3 is an estrogen-inducible kinase promoting estrogen-mediated survival of breast cancer cells〔J〕.Mol Endocrinol，2011;25(1):72-82.

2 Liu M，Chen L，Chan TH.Serum and glucocorticoid kinase 3 at 8q13.1 promotes cell proliferation and survival in hepatocellular carcinoma〔J〕.Hepatology，2012;55(6):1754-65.

3 潘 峰，潘躍銀.乳腺癌分子靶向治療的新進展〔J〕.中華疾病控制雜志，2010;14(6):566-9.

4 張柏林，宋豐舉.乳腺癌基因組學研究進展〔J〕.中國腫瘤臨床，2014;41(3):207-10.

5 Liu HK，Wang Q，Li Y，et al.Inhibitory effects of γ-tocotrienol on invasion and metastasis of human gastric adenocarcinoma SGC-7901 cells〔J〕.J Nutr Biochem，2010;21(2):206-13.