骨性關節炎患者膝關節軟骨及軟骨下骨中miR-214的表達

余曉明，袁雪凌，孟昊業，孫 振，尹合勇，郭全義，彭 江，汪愛媛，盧世璧解放軍總醫院 骨科研究所，北京 00853；南開大學，天津 30007

骨性關節炎(osteoarthritis，OA)是一種臨床上常見的退行性疾病，主要表現為關節軟骨及軟骨下骨的退行性改變、關節疼痛、活動困難、骨贅形成等癥狀，好發于中老年人[1-2]。MicroRNAs(miRNAs，miR)是一個龐大的內源性、非編碼核苷酸序列家族，長度21 ~ 25個核苷酸，主要在轉錄后信使RNA的功能上調控基因的表達[3-5]。近年來，越來越多的miRNAs被證明在骨科疾病中起著重要作用[6]。而miRNA-214被證明在骨質疏松的骨重塑過程中對破骨細胞的功能有調控作用[7]。為進一步研究miR-214的功能，本實驗旨在探究其在骨關節炎發展進程中的表達情況，以便了解miR-214作為骨性關節炎治療靶向標記物的潛在價值。

材料和方法

1 實驗標本 實驗用原發性膝關節骨性關節炎患者及截肢患者脛骨平臺標本，由本院關節外科行人工全膝關節置換術治療的30例OA患者及嚴重創傷需行截肢手術治療的10例患者自愿捐贈。均排除腫瘤、類風濕關節炎、感染及激素治療等因素。其中男性23例，女性17例，年齡31 ~ 82歲。患者術前均行雙膝關節負重位X線檢查，后依據Kellgren-Lawrence X線診斷標準將其分為Ⅰ級組(10例)、Ⅱ級組(10例)、Ⅲ級組(10例)、Ⅳ級組(10例)，進行實驗檢測。

2 RNA提取 將收集的脛骨平臺分離軟骨和軟骨下骨，用陶瓷研缽分別將其在液氮下研碎。將分離的軟骨及軟骨下骨100 mg分別裝入1.5 ml EP管中，用TRIzol提取組織中的RNA，樣本經裂解、分層、RNA沉淀、洗滌和溶解后，使用分光光度計測定RNA濃度和純度，確保后續試驗準確度。

3 反轉錄合成cDNA 按照qPCR反轉錄試劑盒(SYBR Green ReverTra Ace qPCR RT Kit)說明書中要求，配置20μl反應體系，將測定濃度后的RNA樣本加入反應體系進行反轉錄反應。反應在熱循環儀上進行，配置反轉錄體系反應液的所有操作均在冰上進行。反轉錄反應體系成分：5×RT Buffer，4μl；RT Enzyme Mix，1μl；Primer Mix，1μl；RNA sample，2μl；Nuclear free water，加至20μl。反應條件 ：37℃15 min，95℃5 min。

4 實時熒光定量PCR 檢測miR-214：按照qPCR擴增反應試劑盒(SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus)說明書中要求，配置擴增反應混合液，并分別加入miR-214引物，U6為內參引物，最后加入反轉錄合成的cDNA，反應體系成分：SYBR Green RT-PCR Master Mix，10μl；Plus solution，2μl；上游引物，0.5μl；下游引物，0.5μl；cDNA，1μl；Nuclear free water，6μl。引物序列：miR-214，上游為GACAGCAGGCACAGACA，下游為GT GCAGGGTCCGAGG；U6上游為CTCGCTTCGGCAG CACA3，下游為AACGCTTCACGAATTTGCGT。擴增反應條件：95℃1 min，95℃15 s，60℃15 s，72℃45 s，中間兩步共40個循環。反應體系在實時熒光定量PCR機(Applied Biosystems Life Technologies，Foster City，CA，USA)中進行擴增反應。在結果分析中，miRNAs與U6的相對表達量用Delta Ct(ΔCt)表示，其最后表達倍數值用2-ΔΔCt值表示。

5 統計學分析 運用SPSS17.0統計學軟件分析，各組間作比較采用ANOVA方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 miR-214在OA軟骨組織中的表達水平 所有樣本中均有miR-214表達，Ⅳ級組中miR-214的表達水平最高，各組表達水平呈逐漸上調趨勢(圖1)，各組間差異均有統計學意義(P＜0.05)。OA發展嚴重程度與miR-214的表達水平呈正相關。

2 miR-214在OA軟骨下骨中的表達水平 Ⅲ級組中miR-214的表達水平明顯高于其他3組(P＜0.05)。軟骨下骨中miR-214的表達水平差異不同于軟骨中表達水平。見圖2。

圖 1 不同OA分級組軟骨中miR-214的表達情況(aP＜0.05)Fig. 1 Expression level of miR-214 in different grade of OA cartilage(aP＜0.05)

圖 2 不同OA分級組軟骨下骨中miR-214的表達情況(aP＜0.05)Fig. 2 Expression level of miR-214 in different grade of OA subchondral bone (aP＜0.05)

討 論

骨性關節炎主要以關節軟骨退變、軟骨下骨進行性改變、骨贅形成和滑膜炎癥反應為主要特征，嚴重影響著患者的日常生活質量，而目前為止，最有效的治療方法只是人工關節置換術[8-9]。雖然OA為中老年人最常見關節疾病，但發病機制復雜，至今尚未明確。如今，骨關節炎的發病機制已成為越來越多學者的研究熱點[10]。探索骨關節炎的更加有效的治療方法也成為分子生物領域的重點。

miRNAs主要起調控基因表達的作用，在關節疾病的發生發展中有很重要的作用[11]。miR-146a已被發現在OA軟骨中早期高表達，晚期低表達，并且其表達減少是由白介素-1β導致[12]。miR-140亦被證明在OA軟骨中被白介素-1β調控而表達降低，從而引起異常基因的表達，且miR-140還參與骨關節炎軟骨損傷的修復及骨發育等過程，對軟骨及骨的修復和發育具有關鍵作用[13-14]。基于miRNAs在骨和軟骨中復雜的功能，miRNAs被認為是一種新型、高效能的調節OA中基因表達的方法[15]。

在miRNAs在骨和軟骨組織中的調控功能的研究中，miR-214已被發現是一種新型的調控成骨轉化的因子，抑制了小鼠成肌細胞的成骨分化功能[16]；而在成骨細胞中，miR-214通過靶向調控轉錄激活因子的表達，抑制成骨細胞的活性及基質礦化過程，從而促進骨質疏松的發生發展[7]。然而在骨性關節炎的機制研究中，miR-214的功能尚未明確。

通過本實驗，作者證實了miR-214在OA軟骨及軟骨下骨中的異常表達，并且發現，在軟骨中miR-214的表達水平隨著OA嚴重程度的增加而逐漸升高，由此可見，miR-214可能參與OA進程中軟骨損傷的過程，通過調控軟骨相關退化基因而加速軟骨的退化。而在OA的發展過程中，軟骨和軟骨下骨可以構成復合單元，在結構和功能上相互影響[2,17-19]。日常活動中，關節受到過度力學負荷而引發骨重塑，由早期的骨質吸收到晚期的骨質增生，再到最終的晚期骨質硬化和骨贅形成，整個OA病程中都存在骨重塑。而miR-214在軟骨下骨中的異常表達，說明miR-214可能在骨重塑中起重要作用，而在K-L分級的Ⅲ級組中表達最高，證明隨著骨質吸收的增加，miR-214的表達水平逐漸升高，而晚期骨質增生、骨贅形成，miR-214表達下降，由此表明，miR-214可能通過調控成破骨細胞活性而調節骨重塑過程。

綜上所述，本實驗證實miR-214在OA的發病過程中有重要作用，在軟骨退變及軟骨下骨改變中可能調控重要基因的表達，參與軟骨退化及骨重塑。為下一步對miR-214在OA中的調控機制的研究提供理論基礎。通過后期深入研究miR-214在軟骨退變中的調控機制，結合其在骨中的調控功能，將為OA的臨床診斷和治療提供一種新型、有效的思路和方式。

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