?；切苋パ跄懰崧摵狭前愤拎π∈蠼Y腸炎模型的藥效作用及機制

賈立偉，李 欣，朱文婭，孫 濤,第二軍醫大學海軍臨床醫學院，北京 00048；海軍總醫院 消化內科，北京 00048

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)作為炎癥性腸病的一種，表現出許多免疫學疾病特征，與細胞和體液免疫均有關聯[1]。主要臨床表現為反復發作的腹痛、腹瀉、黏液膿血便，有進展為結腸癌的風險。一些并發癥如中毒性巨結腸、腸穿孔等嚴重影響了患者的生活質量。目前臨床上常用的藥物為氨基水楊酸制劑、糖皮質激素、免疫抑制劑及單克隆抗體。然而這些藥物不良反應多，使臨床應用受到限制，如5-氨基水楊酸雖然耐受效果較好，但有肌肉抽筋、腹部絞痛、發熱、皮疹、腎損傷等不良反應。國外文獻報道?；切苋パ跄懰?tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)、熊去氧膽酸在腸道有抗炎作用，減少小腸炎性滲透和氧化應激，調節炎性因子表達，緩解TNBS誘導的小鼠結腸炎[2-3]，但對此尚有爭議[4]。本研究旨在觀察TUDCA聯合SASP對小鼠實驗性結腸炎的干預效果，并探討其可能的作用機制。

材科和方法

1 主要試劑和藥品 葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)(分子量為36 000 ~ 50 000，粉劑，100 g/瓶)購于美國MP公司；?；切苋パ跄懰?、柳氮磺胺吡啶購于海軍總醫院；鄰聯甲苯胺購于上海萬疆生物技術有限公司；小鼠抗體及試劑盒均購于北京博鰲森生物技術有限公司。

2 實驗動物 健康雄性8 ~ 9周齡Balb/c小鼠50只，清潔級，體質量(21.7±2) g，購自海軍總醫院實驗動物中心。室溫條件下常規飼養。

3 動物分組與處理 適應性喂養1周后，50只雄性Balb/c小鼠隨機分為5組，每組10只。分別為正常組、模型組、TUDCA組、SASP組、聯合組。正常組自由飲用蒸餾水，余4組小鼠自由飲用5%DSS溶液，7 d建立實驗性結腸炎模型[5]。造模前1 d，正常組、模型組給予0.2 ml 0.9%氯化鈉注射液，SASP組、TUDCA組分別給予TUDCA(100 mg/kg)、SASP(500 mg/kg)，聯合組給予TUDCA(100 mg/kg)+ SASP(500 mg/kg)，藥物溶于0.9%氯化鈉注射液中，配成0.2 ml溶液，通過小鼠灌胃針灌胃方式注入藥物，1次/d。

4 觀察指標 1)小鼠的一般情況：按照Murano等[6]標準，進行疾病活動指數(disease activity index，DAI)積分評定，每日稱量小鼠體質量，記錄糞便性狀并行隱血試驗。2)組織學損傷評分：顯微鏡下對每個切片隨機選取10個以上高倍視野(400倍)，按照病理組織學損傷評分標準[1]，取平均值作為組織學損傷計分。3)血清TNF-α、IL-6濃度：造模7 d后，通過眼眶后靜脈采血，3 000 r/min離心機分離血清10 min，-20℃冷藏，ELISA法檢測TNF-α、IL-6表達。4)結腸組織Hes1、ATOH1、CDX2的表達：麻醉小鼠后處死，剝離全段結腸，測量肛門距回盲部的長度，0.9%氯化鈉注射液沖洗后，取病變明顯處結腸組織40 g/L甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，4μm切片，HE染色。免疫組化SP法檢測小鼠結腸組織Hes1(細胞質+細胞核)、ATOH1(細胞質+細胞核)、CDX2(細胞核)的表達。其中以PBS代替一抗作陰性對照。結果判斷以出現棕黃色顆粒為陽性，計算機圖像分析系統自動記錄陽性細胞平均光密度。

5 統計學處理 使用SPSS19.0統計軟件，計量資料以-x±s表示，符合方差齊性的計量資料采用單因素方差分析，不符合的采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 小鼠一般情況 正常組小鼠精神狀態、飲食、活動及糞便均正常，體質量略有增加。模型組小鼠3 d后逐漸出現反應遲緩、豎毛、嗜臥扎堆、黏液血便等表現，同時伴有不同程度的體質量減輕。藥物組小鼠上述癥狀出現較晚，癥狀相對模型組較輕。

2 結腸長度的改變 與正常組相比，余4組小鼠結腸長度均縮短，各藥物組縮短程度比模型組輕，差異有統計學意義(P＜0.01)；藥物組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

3 DAI計分 造模第3天，與正常組相比，模型組小鼠DAI評分顯著增高(P＜0.05)，說明造模有效。各藥物組和模型組比較，DAI積分有所下降，造模第5天開始有統計學差異(P＜0.01)；造模第7天，TUDCA、聯合組差異有統計學意義(P＜0.05)，說明TUDCA/SASP聯合用藥比單用TUDCA緩解效果更好；TUDCA、SASP組差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖1。

4 組織學損傷評分 光鏡下結腸組織病理可見模型組結腸黏膜糜爛脫落，炎性細胞浸潤，腺體不完整，隱窩破壞，杯狀細胞減少或消失(圖2)。與模型組比較，藥物組黏膜損傷程度輕，炎癥細胞浸潤、糜爛潰瘍少，組織學評分差異有統計學意義(P＜0.01)；TUDCA、SASP組和聯合組比較，聯合組炎癥損傷輕，差異有統計學意義(P＜0.05)；TUDCA、SASP組差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

5 血清中TNF-a、IL-6的表達 模型組小鼠血清TNF-α、IL-6高表達，各藥物組與模型組比較表達相對較低(P＜0.05)。TUDCA、SASP組差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

圖 1 各組小鼠DAI評分Fig. 1 Disease activity index (DAI) score of mice in fi ve groups (aP＜0.01)

6 小鼠結腸組織Hes1、Atoh1及Cdx2蛋白表達與模型組比較，正常組小鼠結腸Cdx2、Atoh1含量高(P＜0.01)，TUDCA、聯合組干預后，能增加其表達量(P＜0.01)。而Hes1在正常組表達較少， 模型組表達顯著增加，TUDCA、聯合組干預后，能抑制其表達(P＜0.01)。見表2。

表1 各組小鼠結腸長度、組織學損傷評分及血清TNF-α、IL-6表達Tab. 1 Colonic length, histological injury score and the expression of serum TNF - α, IL-6 of mice in fi ve groups(-x±s)

表2 各組小鼠結腸組織Hes1、Atoh1及Cdx2蛋白的表達Tab.2 Expression of Hes1, Atoh1 and Cdx2 protein of colon tissue in mice in fi ve groups (-x±s)

討 論

本研究觀察了牛磺熊去氧膽酸對DSS誘導的結腸炎實驗模型的干預效果，此結腸炎模型類似于人類潰瘍性結腸炎，廣泛應用于治療方法和潛在的抗炎藥物的評估。膽汁酸釋放入腸道后，大部分在末端回腸被重吸收，但每次腸肝循環后，約30%的膽汁酸進入大腸。進入大腸的膽汁酸由于腸道菌群的影響，物理化學性質發生了顯著改變，包括早期解離、脫羥基、脫磺化。炎癥性腸病存在微生態失調，而這與膽汁酸的代謝障礙密切相關，尤其是減少了次級膽汁酸的水平，而親水的次級膽汁酸具有細胞保護功能[7-9]。國內外廣泛研究的次級膽汁酸是?；切苋パ跄懰?，在人體中含量甚微，長期用來治療某些類型的膽汁淤積及原發性膽汁性肝硬化。已有報道證明其有效成分具有抗炎活力[4]。TUDCA能夠阻礙炎癥刺激誘導的內質網應激，許多學者推薦其作為UC新的治療選擇。本實驗進一步證明了TUDCA能有效緩解DSS誘導的小鼠結腸炎模型的病變程度。造模1周后，藥物組體質量下降、結腸長度減少、疾病活動指數評分、病理組織學評分等指標顯著改善，其中聯合組效果最明顯，說明TUDCA聯合SASP可能具有協同效應。

TNF-α是IBD病理進程中的關鍵細胞因子，通過表達黏附分子、成纖維增殖因子、凝血因子，以及啟動細胞毒性反應、凋亡和急性期反應等過程發揮作用[10]。TNF-α的血清水平與UC和克羅恩病(Crohn' s disease，CD)的臨床活動有關[10]。目前TNF-α是潰瘍性結腸炎一個重要的治療靶點。幾種TNF-α抗體已應用于炎癥性腸病治療，取得了良好的效果[11-12]。IL-6改變出現在急性炎癥狀態，如風濕性關節炎、炎癥性腸病、腎小球腎炎等。IL-6主要通過STAT3信號通路在UC的發病，及隨后的UC相關結腸癌腫瘤中發揮重要作用[13]。本研究通過DSS誘導小鼠結腸炎模型，小鼠血清TNF-α及IL-6水平顯著提高，TUDCA能降低血清TNF-α、IL-6水平。這些結果表明，TUDCA可能通過抑制炎性因子TNF-α、IL-6減輕結腸炎病變程度，與國外報道同類藥物的效果相似[14-15]。

Cdx2是一種調節上皮功能相關基因的重要核轉錄因子，并控制腸道上皮細胞的分化和增殖。近期一項研究表明，Cdx2在潰瘍性結腸炎中的表達減少，Cdx2的抑制導致了潰瘍性結腸炎中杯狀細胞的消耗[12]，結果在活動性UC中，黏蛋白合成障礙，黏液層變薄或消失。Notch分子信號通路在細胞的分化中起到了重要的作用，Notch信號的激活導致其重要下游基因Hes1上調以及Atoh1(一種與Notch信號通路相關因子)下調，繼而抑制干細胞分化為杯狀細胞[16]。Atoh1是腸道特異基因Muc2的重要的轉錄激活因子。Tamagawa等[17]報道膽汁酸可以抑制Hes1，并上調Atoh1增加Cdx2表達，從而導致食管鱗狀上皮向柱狀上皮的轉化。本研究顯示，實驗性結腸炎小鼠結腸組織Hes1蛋白表達水平明顯高于正常組，Atoh1、Cdx2蛋白的表達下降。TUDCA能夠減少Hes1蛋白表達水平，增加Atoh1、Cdx2蛋白表達量，進一步說明了膽汁酸、Notch信號通路、Cdx2之間的關系。SASP是經典的氨基水楊酸制劑，可抑制過氧化物酶活性，減少TNF-α刺激產生的IL-l、IL-8等細胞因子的釋放與分泌[18]。本研究也證實了SASP能降低小鼠結腸炎血清炎性因子的表達。總之，在小鼠實驗性結腸炎的發病過程中，激活了Notch信號通路，抑制了黏蛋白的合成。TUDCA能有效緩解結腸炎癥狀，改善腸道組織病理。與SASP可能存在協同作用，聯合用藥可能優于單獨用藥。

綜上所述，?；切苋パ跄懰崧摵狭前愤拎た赏ㄟ^不同機制緩解DSS誘導的小鼠結腸炎，兩者具有協同效應。牛磺熊去氧膽酸作用機制可能是通過調節炎癥因子、抑制Notch信號傳導通路及增加Cdx2蛋白的表達，從而達到對小鼠實驗性結腸炎的緩解作用。

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