小分子化合物誘導干細胞分化為胰島素分泌細胞研究進展

廖菁菁，郝好杰，劉建萍井岡山大學附屬醫院 內分泌科，江西吉安 4000；解放軍總醫院，北京 0085；南昌大學第二附屬醫院 內分泌科，江西南昌 0006

根據國際糖尿病協會(IDF)調查，2011年全球糖尿病患者為3.66億，到2030年預計將達到5.22億，即患病率將達到7.7%[1]。而國內最新大樣本流行病學調查顯示，中國成人糖尿病患病率為11.6%[2]。糖尿病已經成為一種非常普遍的疾病，目前主要是通過口服降糖藥及注射外源性胰島素進行治療，但長期注射胰島素給患者帶來很多不便，也不能阻止各種糖尿病慢性并發癥的發生[3]，因此迫切需要一些新的治療方法。糖尿病是由于胰島B細胞受損，導致胰島素分泌缺陷和(或)作用缺陷，從而使患者血液中葡萄糖水平增高。如能重建患者體內有功能的B細胞，就有可能治愈糖尿病。近年來，細胞治療成為非常有前景的治療方法。目前，將各種來源的細胞誘導分化或轉分化為胰島素分泌細胞(insulin-producing cells，IPCs)[4-6]，為糖尿病細胞治療開辟了一條新道路。關于IPCs再生來源的干細胞已有綜述報道[7]，但有關IPCs的誘導方法及小分子化合物在干細胞向IPCs誘導分化過程中的作用的文獻報道較少。本文就各種來源干細胞向IPCs分化的誘導方法及相關小分子化合物在誘導過程中所起的作用進行綜述。

1 胰島素分泌細胞的來源

現階段研究較多的用于治療糖尿病的干細胞可分為3類：胚胎干細胞、誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPs)及成體干細胞。胚胎干細胞是一種全能干細胞，具有多向分化潛能及自我更新能力，在適當的條件下可分化為3個胚層細胞，包括IPCs[8-9]。最初誘導效率較低，且生成的IPCs對葡萄糖刺激不敏感，隨著不斷的研究，尤其是利用小分子化合物分階段誘導后，誘導效率明顯提高，誘導出的IPCs對葡萄糖的敏感性也大大提高了[7]。

目前，用確定的轉錄因子將體細胞重編程為誘導性多能干細胞的方法已經建立[10-11]，這些iPS細胞與胚胎干細胞有相似的特性，具有多向分化及自我更新能力。同時自體細胞來源的多能干細胞避免了免疫排斥問題，也避開了倫理及法律上的爭議。不同來源的iPS細胞在動物模型中可治療各種疾病，包括將其誘導分化為IPCs治療糖尿病[12-14]。

成體干細胞是胚胎干細胞分化形成的各特定類型細胞的干細胞或前體細胞，在適當的條件下可以轉分化為其他類型的細胞，包括轉分化為IPCs[15]。這種轉分化過程包括幾種可能的途徑：1)從一種已分化細胞轉分化為另一種分化細胞；2)已分化的細胞去分化為一種共同的前體細胞后再分化為另一種細胞；3)將成體組織中存在的多能細胞誘導分化為另一種細胞；4)與另一已分化的細胞融合為多能細胞。成體干細胞相對胚胎干細胞來說，取材更方便，成瘤風險更低，且無倫理上的爭議[16]。

2 小分子化合物誘導IPCs生成

Hou等[17]用7種小分子化合物將小鼠成體細胞誘導為多能細胞，這種應用小分子化合物進行重編程的非轉基因方法較轉基因方法對臨床意義更大，因為小分子化合物無免疫原性、可滲入細胞、操作方便、容易合成及保存，且其對特異蛋白的抑制或激活功能多是可逆的，應用時濃度可以準確控制[17]。目前，已有很多實驗室通過不同的生長因子與小分子化合物的組合，直接將胚胎干細胞、誘導性多能干細胞及成體干細胞分階段誘導分化為IPCs，表1中歸納了部分作者的誘導方案。

3 小分子化合物在IPCs誘導分化過程中的作用

從表1中可以看到不同的細胞誘導分化為IPCs需要不同的培養基、生長因子及小分子化合物，但它們也有一些共同的特點，如都是分階段進行誘導，誘導分化過程中使用的生長因子及小分子化合物部分是一樣的。這些生長因子及小分子化合物可促進B細胞的增殖和分化、增加胰島素含量。如表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)是EGF蛋白家族中的一員，對細胞的存活、增殖及分化起重要作用[23]，已有研究發現其可以促進胰十二指腸同源框蛋白1陽性細胞增殖[12]。堿性成纖維生長因子與EGF聯合使用或單獨使用，有利于IPCs分化[24-25]。激活素A是轉化生長因子-β超家族的成員，可調節細胞的增殖和分化，誘導胚胎干細胞向終末內胚層分化，與其他細胞因子聯合作用可進一步誘導分化為IPCs[24,26]。5-氮雜胞苷，一種DNA甲基化酶抑制劑，可逆轉DNA的甲基化過程，刺激分化過程中胰腺內分泌細胞相關轉錄因子(Ngn3、Pdx1)的表達。Pennarossa等[27]利用5-AZA使人成纖維細胞經過一個短暫的去甲基化狀態后，成功轉分化為IPCs，將重編程所得IPCs移植入糖尿病小鼠體內后可逆轉其高血糖狀態。曲古霉素A，一種非特異組蛋白去乙酰化酶抑制劑，可調節染色體重構，使干細胞去分化，并進一步向胰腺內分泌細胞分化，增加內分泌細胞的數量，與5-AZA聯合應用可促進骨髓間充質干細胞、肝干細胞向IPCs分化[19-22]。維甲酸可誘導人胚胎干細胞表達胰腺發育過程中重要的轉錄因子Ngn3和神經源性分化因子，并進一步促進Pdx1、成對盒基因4(Pax4)及同源盒基因6.1(Nkx6.1)表達，誘導生成IPCs[28-29]。尼克酰胺是各種誘導方案中常用的一種小分子化合物，早在20世紀90年代，Otonkoski等就利用尼克酰胺誘導人胎胰向內分泌細胞分化，其研究表明，用10 nmol/L尼克酰胺作用于未分化的上皮細胞簇，可使發育過程中的胰島B細胞DNA含量增加2倍，胰島素含量增加3倍，同時，胰島素、胰高血糖素及生長抑素的基因表達量也增加了[16]。艾塞那肽-4是胰高血糖素樣肽1(GLP-1)激動劑，可通過刺激B細胞的復制及再生增加B細胞團的數量，并可增加胰島素基因表達及胰島素原的合成，與利索茶堿共作用時可逆轉受損的糖尿病鼠的B細胞[30]。也有報道體外高濃度的艾塞那肽-4可增加小鼠胚胎干細胞來源的IPCs胰島素的分泌量[31]。艾塞那肽-4與激活素A聯合作用，可上調Pdx1、Ngn3，胰島素、胰高血糖素、生長抑素、胰多肽及葡萄糖轉運子2(Glut2)的表達，這些基因可促進有功能的B樣細胞的生成[20]。

表1 小分子化合物誘導干細胞分化為胰島素分泌細胞Tab. 1 Differentiation of stem cells into insulin-producing cells using small molecule compounds

4 展望

近年來的研究表明，不同來源的細胞通過轉基因[26,32]及非轉基因[12,18,22]的方法都可以誘導分化或轉分化為IPCs，因此選擇一個最佳的細胞類型及誘導方案也是目前一個比較棘手的問題。胚胎發育過程中，肝與胰腺共同來源于內胚層，發育上的同源性提示肝和胰腺在細胞增殖及分化調控等方面有很高的相似性[33]，兩者之間的轉化涉及相對較少的表觀基因改變，且肝具有強大的修復與再生能力，能為胰島素分泌細胞的重編程提供大量的細胞來源。近來的研究發現，miR-302可促進Pdx1、Ngn3、V-MAF肌肉腱膜纖維肉瘤癌基因同源A(MafA)將人成體肝細胞重編程為胰島素分泌細胞，過表達miR-302a可增加胰腺發育相關基因Pdx1的表達[34]。因此，將肝細胞重編程為胰島素分泌細胞在糖尿病細胞治療方面具有很大潛力。非內分泌的胰腺細胞及胰島細胞與胰島B細胞來源同一胚層，或許會是一個比較好的選擇[35]。轉基因方法存在轉染基因整合及誘變的風險[8]，因此通過小分子化合物這種非轉基因的方法誘導分化或重編程出IPCs的策略越來越受到人們的關注。小分子化合物更像是一種藥物，通過小分子化合物抑制或激活組織細胞發育過程中相關基因及信號通路將細胞進行誘導分化及轉分化。但是，目前我們對于各種小分子化合物的作用機制及其與胰腺發育過程中各信號通路是如何相互影響的并不清楚。想要通過小分子化合物誘導出我們需要的產胰島素細胞，就需要了解各組織自然發育過程中基因表達及小分子化合物是如何調節這種復雜的基因網絡系統的。這需要我們進行深入研究，這是一個很艱辛的過程，是一個挑戰，但又吸引我們不斷探索，因為我們了解的越多，解析的越清楚，離治愈糖尿病的日子就越近。

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