雞腿菇原生質體制備與再生研究

盧月霞　鄭素月　柳煥章

摘要：以雞腿菇雙核菌絲為材料，利用溶壁酶制備原生質體，采用單因素試驗確定最佳條件。結果表明，原生質體產量最高的條件是取菌齡為5 d的液體靜置培養的菌絲體，以0.6 mol/L蔗糖為滲穩劑，在酶解溫度30 ℃、酶濃度 20 g/L、菌絲量20 g/L的條件下酶解3 h，制備的原生質體量為 2.5×107個/mL。將制備的原生質體稀釋并涂布于再生培養基，再生率為10.9%，研究為雞腿菇原生質體融合及優良品種選育提供研究基礎。

關鍵詞：雞腿菇；原生質體；制備；再生

中圖分類號： S646.03 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0260-02

雞腿菇別稱毛頭鬼傘（Coprinus comotus），是一種具有營養保健功能的珍稀食用菌，是人工開發的具有商業潛力的珍稀食用菌新品，被譽為“菌中新秀”。雞腿菇生長周期短，生物轉化率較高，易于栽培，具有降血糖、降血脂、提高免疫活性、抗腫瘤、抑菌等一系列生物活性[1]，深受消費者歡迎。

近年來，原生質體技術成為了研究蕈菌生理、生化、遺傳等基礎理論和改良菌種的一種重要方法和有效手段[2]。該技術可以實現遠緣雜交、擴大遺傳物質的重組范圍以及基因轉化和定向誘變，獲得具有突出優良性狀的新類型，產生更豐富的遺傳變異[3]。在國內，食用菌原生質體融合正在廣泛地開展，進行原生質體融合，首先必須獲得大量有活力的原生質體，因此必須對原生質體的分離和再生條件做深入研究[4]。迄今為止，關于雞腿菇原生質體制備和再生的研究在國內鮮有報道，本研究探索雞腿菇原生質體制備及再生的較適條件，旨在為雞腿菇新品種選育及基因工程研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 雞腿菇1號由中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所提供，為ACCC編號菌株。

1.1.2 培養基

（1）PDA綜合培養基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，MgSO4 0.5g，KH2PO4 1 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。（2）MYG培養基：麥芽糖10 g，葡萄糖4 g，酵母膏4 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。（3）MYG再生培養基：麥芽糖10 g，葡萄糖4 g，酵母膏4 g，0.6 mol/L蔗糖，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 原生質體制備條件研究

將雙核菌絲接種于PDA平板中，于25 ℃培養10 d，再將活化菌絲接種于PDA液體培養基中，于25 ℃靜置培養6～7 d。取新鮮的雞腿菇菌絲用無菌濾網過濾，再用無菌蒸餾水于3 500 r/min洗滌5 min，洗滌2次。無菌濾紙吸干菌絲水分，分別研究酶解時間、滲穩劑種類、菌絲量、菌齡對原生質體產生量的影響。在優化條件下30 ℃酶解完畢后，采用無菌脫脂棉過濾法過濾除去殘留菌絲，濾液于8 000 r/min 洗滌10 min，棄上清液、收集沉淀，適量稀釋后用血球計數板計數。

1.2.2 原生質體再生研究

原生質體用滲穩劑稀釋至 104個/mL 左右，取0.1 mL涂布于再生培養基上，接種后在恒溫箱25 ℃遮光培養，用無菌接種針在顯微鏡下挑取單個原生質體菌落，轉至PDA試管斜面上，25 ℃再擴大培養10 d；最后，根據單核菌絲無鎖狀聯合的特點鏡檢確定挑取的單菌落是否為單核體，舍棄有鎖狀聯合的個體，獲取再生菌落，觀察計數。再生率=（再生培養基上生長的菌落數-PDA培養基上生長的菌落數）/接種數×100%。

2 結果與分析

2.1 原生質體制備條件研究

2.1.1 滲穩劑種類及酶解時間對原生質體產量的影響

據文獻[5]報道，常用的滲穩劑包括氯化鉀、硫酸鎂、甘露醇、蔗糖4種，且有機滲穩劑比無機滲穩劑效果好，通過預試驗發現添加硫酸鎂的培養基平板長時間不凝固，添加氯化鉀的培養基凝固太快，來不及倒平板。因此，本試驗選擇0.6 mol/L甘露醇、蔗糖2種滲穩劑，分別取0.01 g菌絲放入酶濃度為 20 g/L 的以0.6 mol/L甘露醇、蔗糖為滲穩劑的1 mL無菌酶解液中，30 ℃酶解5 h，每隔0.5 h取樣測原生質體量。從圖1可以看出，以蔗糖作滲穩劑產原生質體量遠遠高于甘露醇，而且隨著酶解時間延長，原生質體量先呈上升趨勢，在3 h達到峰值8.1×106個/mL，隨后又呈下降趨勢。這是因為在酶解的開始，菌絲逐漸解體，釋放原生質體的速度加快，數量增多；3 h 后，酶活性降低，且釋放的原生質體會隨著酶解時間的延長而破裂，所以原生質體量會減少。

2.1.2 菌絲量對原生質體產量的影響

分別稱取0.01、002、0.03、0.04、0.05 g菌絲放入酶濃度為20 g/L的以 0.6 mol/L 蔗糖為滲穩劑的1 mL無菌酶解液中酶解3 h。由圖2可知，菌絲量為0.02 g的酶解液原生質體量最高，達到8.8×106個/mL；之后隨著菌絲量的增多，原生質體量呈下降趨勢。因此，菌絲量是否適合是影響原生質體產量高低的重要因素。

2.1.3 菌齡對原生質體產量的影響

分別稱取3、4、5、6、7 d菌齡的純凈菌絲0.02 g，放入酶濃度為20 g/L的以0.6 mol/L蔗糖為滲穩劑的1 mL無菌酶解液中酶解3 h。由圖3可知，5 d 菌齡的菌絲釋放的原生質體量最高，而且活力強，多數含有細胞核，容易再生；少于或多于5 d菌齡的菌絲細胞過于幼嫩或老化，不易被酶解，因此原生質體量較少，活力差。優化條件下制備的原生質體量為2.5×107個/mL，該條件下純化的原生質體見圖4。

2.2 原生質體再生研究

取0.1 mL稀釋到104個/mL的原生質體懸液分別涂布以甘露醇、蔗糖為滲穩劑的再生培養基平板，以不加滲穩劑的PDA 平板作對照，25 ℃下恒溫培養，8 d后再生菌落肉眼可見，對照板無菌落出現，說明原生質體已經純化。在不同滲穩劑平板上原生質體再生率明顯不同。其中蔗糖板再生率為10.9%，甘露醇板再生率為8%，可見雞腿菇再生培養基的最適滲穩劑不是甘露醇，而是蔗糖。

3 結論與討論

研究結果表明，雞腿菇原生質體產量最高的條件是取菌齡為5 d的液體靜置培養的菌絲體，以0.6 mol/L蔗糖為滲穩劑，在酶解溫度30 ℃、酶濃度20 g/L、菌絲量20 g/L的條件下酶解 3 h，優化條件下制備的原生質體量為2.5×107個/mL。將純化的原生質體稀釋并涂布于蔗糖板再生培養基，再生率為109%。

影響原生質體產量高低的因素有很多，包括酶解溫度、酶濃度、酶解時間、菌齡、滲穩劑種類等。本研究分析主要因素對原生質體產量的影響，初步分析雞腿菇原生質體制備和再生條件，為雞腿菇新品種選育提供研究基礎。

本研究通過對雞腿菇原生質體制備及再生條件的初步研究，優化了其制備條件，為進一步開展原生質體技術研究及育種奠定了基礎。

參考文獻：

[1]何 文. 雞腿菇營養價值高開發前景廣闊[J]. 資源開發與利用，2000（4）：11-12.

[2]劉文芳，郭成金. 白靈菇原生質體制備與再生研究[J]. 天津師范大學學報：自然科學版，2012，32（1）：88-92.

[3]朱 堅，張 鵬. 白靈菇原生質體制備條件的優化[J]. 中國農學通報，2011，27（25）：153-157.

[4]廖漢泉，邱景蕓，吳月嫦. 香菇菌絲原生質體分離與再生條件的研究[J]. 遺傳，1990，12（6）：8-11.

[5]劉玉霞，王 謙，陳瑞玲，等. 白靈菇原生質體制備及再生的研究[J]. 食用菌，2009（4）：24-25.