三葉木通下胚軸愈傷組織誘導及分化

蘇慧慧　韓興杰　李同建　徐玲玲　徐小青　胡蘭英+廖亮

摘要：以三葉木通試管苗下胚軸為材料，研究不同激素配比對三葉木通下胚軸愈傷組織誘導、分化的影響，比較光照及不同抗褐化劑對防止愈傷組織褐化的影響。結果表明，當2，4-D濃度為2.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L時，愈傷組織誘導率高達96.5%；黑暗處理比光照更有利于愈傷組織的誘導，0.6 g/L PVP對預防愈傷組織褐化具有較好的效果；TDZ的濃度對愈傷組織的分化有著重要的影響，適合愈傷組織分化的最佳培養基為：MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L。

關鍵詞：三葉木通；愈傷組織；分化

中圖分類號：S567.904.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0050-03

三葉木通[Akebia trifoliata （Thunb.） Koidz]是木通科（Lardizabalaceae）木通屬（Akebia）的一種果實營養價值較高的半落葉藤本野生果樹[1]，別稱八月瓜、八月扎、炸瓜。主要分布于中國甘肅南部、陜西南部，湖南、湖北、山西、河南等地也有少量分布[2]。研究發現，三葉木通種子脂肪酸含量較高，且主要以不飽和脂肪酸為主[3]；果實味美、營養豐富，蛋白質、氨基酸、可溶性糖、有機酸和礦物質含量也很高，被譽為果中之王[4]，具有較高的經濟價值和開發價值。三葉木通是中國傳統中藥，有清心火、利小便、通經下乳作用[5]。近年來，國內學者對三葉木通的研究主要集中在藥用成分分析以及扦插栽培等方面[6-7]，組織培養方面研究較少，目前，只有愈傷組織誘導的研究，且誘導率較低，尚無關于三葉木通愈傷組織分化成苗的相關報道。本試驗對三葉木通下胚軸愈傷組織誘導及分化進行了研究，研究不同生長調節劑種類、濃度組合對三葉木通下胚軸再生的影響，以期建立三葉木通下胚軸高效離體再生體系，為其遺傳轉化體系的建立奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

三葉木通種子由湖南懷化種植基地提供。

1.2 方法

1.2.1 無菌外植體的獲取 挑選富有光澤、飽滿的種子，置于超凈工作臺內，無菌水浸泡24 h，使其充分膨脹。75%的乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗3次，0.1%的氯化汞浸泡10 min，無菌水沖洗3次，置于無菌濾紙上吸干多余水分，用解剖針劃開種皮，將胚取出，分別接種于MS培養基、1/2 MS培養基、MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L和1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養基中誘導種子萌發，24 h光照培養7 d，統計試驗結果。

1.2.2 愈傷組織誘導培養基的篩選 切取長度約為5 mm的三葉木通下胚軸，以MS為基本培養基，選用3因素3水平正交試驗設計L9（33）方案，觀察2，4-D、NAA、KT 3種植物激素的濃度及配比對愈傷組織誘導的影響（黑暗培養），每瓶接5個材料，每組處理10瓶，40 d后統計愈傷組織誘導結果。

1.2.3 光照對愈傷組織誘導影響及抗褐化劑的篩選 切取長度約為5 mm的下胚軸，接種于MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L中，分別進行黑暗、光照、黑暗20 d再光照 20 d 3種處理方案培養，定期觀察并記錄生長情況，40 d后統計試驗結果。將約5 mm大小的外植體接種于愈傷誘導培養基MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L中，分別添加維生素C 10、20、50 mg/L，AC（活性炭）0.5、0.8、1.0 g/L，PVP（聚乙烯吡咯烷酮）0.6、0.8、1.0 g/L的抗氧化劑和吸附劑，以不添加任何抗褐化劑和吸附劑作為空白對照，黑暗處理，40 d后統計愈傷組織的褐化程度及生長狀態。

1.2.4 愈傷組織分化培養基的篩選 將長勢較好的愈傷組織轉移于培養基：（1） MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L；（2） MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L；（3） MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L；（4） MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L，每瓶接5個材料，每個處理重復10瓶。黑暗處理 10 d 后，光照培養，50 d后分別觀察并記錄愈傷組織分化結果。

1.2.5 培養條件 培養基pH值為5.8～5.9，瓊脂8 g/L，蔗糖30 g/L，培養溫度（24±1） ℃，培養室濕度為60%～70%，光照時間為24 h/d（黑暗處理及光照試驗除外），光照度為1 200～1 500 lx。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對無菌外植體獲得的影響

觀察發現，3 d后接種在MS和1/2MS培養基中的種胚變綠且子葉張開，下胚軸開始伸長；另外2組培養基幾乎沒有變化。7 d后不同培養基中的下胚軸長度存在差異，子葉形態也不同（表1）。接種于MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L和1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養基中的種胚不能形成健壯幼苗，發育畸形。因此，將MS培養基作為獲得外植體的最佳培養基。

2.2 愈傷組織誘導培養基的選擇

觀察發現，接種7 d左右下胚軸兩端切口處開始膨大，40 d 后愈傷組織形成，愈傷組織誘導結果見表2。當激素配比為2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L時，愈傷誘導率最高，為96.5%。為進一步觀察各控制變量是否對觀測變量產生影響，利用SPSS軟件進行多因素多水平的方差分析，結果見表3。

由表3可知，2，4-D、NAA 2個因素對愈傷組織誘導率的影響都極為顯著，KT則不顯著。即2，4-D、NAA 2種激素的3種濃度處理間差異均為顯著；KT的3種濃度處理間差異不顯著。為了篩選2，4-D、NAA的最佳濃度，對2因素進行Duncan檢驗，結果見表4、表5。

2.2.1 2，4-D 3個濃度水平的Duncan檢驗 多重分析比較結果見表4，2，4-D 3個濃度間差異顯著；2.4-D 3.0 mg/L與 4.0 mg/L 差異極顯著，就平均值來看2，4-D 2.0 mg/L的誘導平均值最高，因此，確定三葉木通下胚軸愈傷組織誘導適宜的2，4-D濃度為2.0 mg/L。

2.2.2 NAA 3個濃度水平的Duncan檢驗 多重分析比較結果見表5，NAA的3個濃度間差異顯著；而NAA 0.2 mg/L與 06 mg/L 間差異極顯著。 就平均值來看， NAA 0.2 mg/L 平

均值最高，因此，確定三葉木通下胚軸愈傷組織誘導適宜的NAA濃度為0.2 mg/L。

試驗結果表明，2，4-D、NAA 2種植物激素及其配比對愈傷組織的誘導率有極顯著影響，當2，4-D濃度為2.0 mg/L，NAA濃度為0.2 mg/L時愈傷組織誘導率最高。

2.3 光照時間及不同抗褐化劑對愈傷組織的影響

試驗結果表明，黑暗處理條件下愈傷組織誘導率最高，且生長狀態好，呈淺黃色；光照條件下的愈傷組織褐化率高達100%，愈傷組織呈深褐色；黑暗20 d再光照20 d培養的愈傷組織開始時呈淺黃色，當進行光照培養5 d后觀察到約40%愈傷組織開始慢慢變成褐色，20 d后愈傷組織的褐化率高達60%。表明黑暗條件下培養可很大程度上降低三葉木通的褐化。不同抗褐化劑對愈傷組織的影響見表6。

常用抗氧化劑維生素C 及吸附劑AC 并沒有起到很好的抗褐化作用，而PVP 0.6 g/L對防止褐化有相對較好作用，本結果與劉香在超聲對三葉木通葉片愈傷組織生長及代謝影響得出的結論[8]一致。

2.4 愈傷組織分化培養基的篩選

將愈傷組織接種于培養基后，定期觀察分化情況。培養30 d后觀察到2號和4號培養基仍未分化且愈傷組織呈黑褐色，35 d后愈傷組織表面有芽點冒出。接種到1號和3號培養基的愈傷組織也有少量呈黑褐色，但已明顯分化，呈團簇狀。50 d后愈傷分化情況見表7。由表7可以看出，3號培養基MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L的長勢最好，芽分化程度最高，為適宜分化培養基，分化情況見圖1。

3 結論與討論

本試驗中種胚接種于不同的培養基時下胚軸長度存在很大差異，在添加植物激素的培養基中下胚軸的長度較短，可能是由于外源激素與種胚本身內源激素相互作用抑制了生長。種胚接種于1/2 MS培養基中下胚軸長度也較短，可能是大量元素減半而導致種胚在萌發過程中大量元素不足的原因。

三葉木通中含有豐富的酚類物質，因此在愈傷組織培養過程中易發生褐化現象，從而影響培養的效果[9-11]，豐富的酚類物質還會在三葉木通果汁飲料的加工過程導致果汁色澤褐變[12]。光照對愈傷組織誘導過程中的褐化現象有著很強的誘導作用[13]。試驗結果，PVP 0.6 g/L對防止褐化有著較好的作用，褐化程度明顯降低，可能是與PVP吸附了酚類氧化物質有關。李然紅等在甘藍組織培養中也發現PVP對褐化抑制作用明顯[14]。

在組織培養中，外植體的類型以及適當濃度配比的細胞分裂素和生長素都對愈傷組織形成有著很重要的影響[15-16]，本試驗以下胚軸為外植體，通過正交設計篩選出適宜誘導愈傷組織的培養基為：MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。沈國林等以三葉木通葉片為外植體，篩選出最適宜誘導愈傷組織的培養基為MS+2，4-D 4.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 1.0 mg/L[5]，但愈傷誘導率只有87.5%，低于本研究的96.5%，且沒有進行分化研究。

本試驗在解決了三葉木通愈傷誘導及褐化問題后，利用得到的愈傷組織進行了分化的初步研究，篩選出適宜的分化培養基為MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L，為后續快繁體系的建立奠定了基礎。

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