桑青枯雷爾氏菌MR111的GspF基因的獲取與結(jié)構(gòu)分析

楊金宏

摘要：GspF是細(xì)菌Ⅱ型分泌系統(tǒng)的內(nèi)膜平臺(tái)的重要蛋白，利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，獲得了桑青枯雷爾氏菌MR111的含有該類基因功能性結(jié)構(gòu)域的GspF基因。NCBI在線BLASTP分析發(fā)現(xiàn)，該基因與雷爾氏菌屬來(lái)源的同源基因的一致性在90%以上；在聚類分析中，首先所有雷爾氏菌屬同源基因聚合在同一分支，后與皮氏羅爾斯頓菌的同源基因聚合。基因結(jié)構(gòu)分析表明，該基因有2個(gè)由α螺旋組成的具有高度相似性的、跨膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，揭示該基因可能參與細(xì)菌的跨膜分泌。

關(guān)鍵詞：桑青枯雷爾氏菌；Ⅱ型分泌系統(tǒng)；GspF基因；結(jié)構(gòu)分析

中圖分類號(hào)：S888.71+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）07-0038-03

植物致病細(xì)菌Ⅱ型分泌系統(tǒng)（T2SS）是由12～15個(gè)分泌途徑轉(zhuǎn)膜蛋白（GSP）基因簇為中心組成的復(fù)合體，向細(xì)胞外分泌毒性因子、胞外酶、毒素等許多重要的蛋白質(zhì)，通過(guò)2步將蛋白從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外[1]。GspF、GspL、GspM、GspE等共同組成T2SS的內(nèi)膜平臺(tái)，組裝其他分泌元件，控制分泌通道的開(kāi)啟[2]。GspF是內(nèi)膜平臺(tái)中具有重要作用、并具有廣泛分布的胞質(zhì)膜蛋白，Thomas等通過(guò)分析GspF的氨基酸序列，結(jié)合歐文氏桿菌（Erwinia carotovora）的GspF與BlaM融合試驗(yàn)證實(shí)GspF穿過(guò)內(nèi)膜3次，其N末端和C末端分別位于細(xì)胞質(zhì)和周質(zhì)[3]。2007年Arts等進(jìn)一步通過(guò)堿性磷酸酶融合試驗(yàn)證實(shí)了綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）中GspF的同源物的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，證實(shí)了GspF是一個(gè)質(zhì)膜蛋白[4]。2009年，Abendroth等對(duì)來(lái)自霍亂弧菌（Vibrio cholerae）的EpsF（GspF的同源基因）的N末端的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，其由6個(gè)反向平行α螺旋組成。2個(gè)分子EpsF蛋白的N-末端結(jié)構(gòu)域形成1個(gè)緊密的二聚體并具有保守的結(jié)合界面[5]。Peabody等對(duì)大量來(lái)自細(xì)菌的GspF基因序列的分析表明，所有基因類似，且其2個(gè)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域是內(nèi)部重復(fù)序列[6]。

植物青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的是一種具有嚴(yán)重危害的土傳性病害[7]，本研究以桑青枯雷爾氏菌為研究對(duì)象，獲得了桑青枯雷爾式菌的GspF基因的序列，并分析了其結(jié)構(gòu)特征，為進(jìn)一步研究桑青枯雷爾氏菌Ⅱ型分泌系統(tǒng)的基因功能和泌出機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

桑青枯雷爾氏菌MR111由陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)并保存。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。dNTPs、EX Taq DNA聚合酶等為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。培養(yǎng)桑青枯雷爾氏菌用的TTC固體培養(yǎng)基和SPA液體培養(yǎng)基等相關(guān)試劑均為分析純，自行配制。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桑青枯雷爾氏菌MR111的活化與培養(yǎng) 超低溫冰箱取出保存的桑青枯雷爾氏菌，劃線于高壓滅菌的TTC培養(yǎng)基，于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，活化菌株。挑取TTC培養(yǎng)基生長(zhǎng)的單菌落于SPA培養(yǎng)基，繼續(xù)置于26 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.2 桑青枯雷爾氏菌基因組DNA的提取與GspF基因的PCR擴(kuò)增 收集培養(yǎng)過(guò)夜的桑青枯雷爾氏菌MR111，按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明提取基因組DNA，并以此為模板，以設(shè)計(jì)的GspF基因的PCR擴(kuò)增引物（F：5′-CGATATGCCAGCCTTCC-3′；R：5′-CGTGACCTGTTGT-TTGA-3′）進(jìn)行PCR反應(yīng)，由于Gsp基因簇的GC含量相對(duì)較高（約70%），擴(kuò)增體系中同時(shí)加入5%二甲基亞砜（DMSO），擴(kuò)增桑青枯雷爾氏菌的GspF基因。使用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工武漢測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 GspF基因序列的分析 NCBI在線BLAST比對(duì)桑青枯雷爾氏菌MR111的GspF基因序列[8]，結(jié)合Rost等的方法[9]，分析基因編碼氨基酸的結(jié)構(gòu)域，并下載其他同源基因序列，進(jìn)行序列的比對(duì)和結(jié)構(gòu)的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑青枯雷爾氏菌MR111的GspF基因序列的獲取

以提取的桑青枯雷爾氏菌的基因組DNA為模板，GspF基因擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果在1 000 bp上方獲得單一擴(kuò)增條帶（圖1）。回收該條帶并進(jìn)行測(cè)序，獲得GspF基因121 bp 至終止密碼子后49個(gè)堿基共1 138 bp的序列（GenBank登錄號(hào)：KM115545）。

NCBI在線分析基因編碼氨基酸，結(jié)果表明同其他基因一樣，GspF編碼的氨基酸有2個(gè)具有高度保守性的T2SF

（pfam00482）結(jié)構(gòu)、GspF（TIGR02120）結(jié)構(gòu)以及T2SS系統(tǒng)的組分GspF的典型結(jié)構(gòu)PulF（COG1459）（圖2）。

2.2 GspF基因的比對(duì)與聚類分析

NCBI在線BLASTP比對(duì)分析，GspF基因與其他來(lái)源青枯雷爾氏菌、皮氏羅爾斯頓氏菌（Ralstonia pickettii）等雷爾氏菌屬（Ralstonia sp.）的其他菌株的同源區(qū)域的一致性在90%以上，與伯克氏菌屬（Cupriavidus sp.）、伯克霍爾氏菌（Burkholderia sp.）等的相似性在均在80%以上。MEGA 5.0軟件[10]構(gòu)

建GspF基因的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖3所示。所有青枯雷爾氏菌的GspF基因聚合后與雷爾氏菌屬和羅爾斯頓氏菌的同源基因聚合在一起，而伯克霍爾氏菌單獨(dú)位于樹(shù)的最遠(yuǎn)分支，這與傳統(tǒng)分類一致。

2.3 GspF基因結(jié)構(gòu)的分析

V. cholerae的EpsF基因的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域已通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，本研究結(jié)合BLAST比對(duì)和Rost等的方法[8-9]分析基因結(jié)構(gòu)，結(jié)果2個(gè)基因的2個(gè)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的相似性均在80%以上（圖4-A、B），GspF的前后2個(gè)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域間的相似性也在50%以上（圖4-C），基因的C端、N端都具有6個(gè)α螺旋，Met（171）、 Val（192）之間具有跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。這與Peabody等分析的2個(gè)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域是內(nèi)部重復(fù)序列一致[6]。

3 討論與結(jié)論

革蘭氏陰性菌中，細(xì)菌的跨膜分泌蛋白占細(xì)胞總蛋白的20%，與細(xì)菌毒素分泌到胞、表達(dá)細(xì)胞表面的膜蛋白等生命活動(dòng)有關(guān)[11]。目前已經(jīng)在革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)7種蛋白分泌機(jī)制，其中Ⅱ型分泌系統(tǒng)在革蘭氏陰性細(xì)菌中廣泛存在，該分泌系統(tǒng)以轉(zhuǎn)膜蛋白GSP基因簇為中心，突變會(huì)造成許多蛋白分泌的缺乏[12-13]。本研究獲得的桑青枯雷爾氏菌的GspF是具有廣泛分布的胞質(zhì)膜蛋白，BLAST軟件分析GspF（EspF）基因間具有高度的相似性，MR111的GspF基因與其他來(lái)源青枯雷爾氏菌、皮氏羅爾斯頓氏菌以及雷爾氏菌屬的其他菌株的同源區(qū)域的一致性在90%以上。基于該基因進(jìn)行聚類分析，所有雷爾氏菌屬聚合后再與羅爾斯頓氏菌的同源基因聚合，伯克霍爾氏菌單獨(dú)位于樹(shù)的最遠(yuǎn)分支，說(shuō)明GspF基因的進(jìn)化與細(xì)菌的進(jìn)化是一致的，沒(méi)有經(jīng)歷基因的水平轉(zhuǎn)移[14]。

作為組成T2SS內(nèi)膜平臺(tái)的蛋白之一，GspF基因存在于所有的T2SS分泌系統(tǒng)中[1，15]，V. cholerae的基因EspF的二級(jí)結(jié)構(gòu)中存在6個(gè)反向平行螺旋，形成具有多個(gè)α螺旋構(gòu)成的跨膜區(qū)，把疏水基團(tuán)放在骨架外側(cè)，而親水基團(tuán)位于螺旋內(nèi)側(cè)，與有疏水性的脂雙層結(jié)構(gòu)的細(xì)胞膜融合，實(shí)現(xiàn)穿過(guò)細(xì)胞膜的分泌[5]。EspF與GspF形成α螺旋的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的相似性在80%以上，GspF的2個(gè)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域也具有50%以上相似性，均體現(xiàn)了作為分泌系統(tǒng)的重要組成基因在基因序列和結(jié)構(gòu)上的保守性。

本研究通過(guò)PCR技術(shù)獲得了桑青枯雷爾式菌MR111的GspF基因，并分析了基因間的相似性和結(jié)構(gòu)特征，為進(jìn)一步研究該菌的分泌機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。〗

參考文獻(xiàn)：

[1]Sandkvist M. Type Ⅱ secretion and pathogenesis[J]. Infect Immun，2001，69（6）：3523-3535.

[2]Lory S. Secretion of proteins and assembly of bacterial surface organelles：shared pathways of extracellular protein targeting[J]. Current Opinion in Microbiology，1998，1（1）：27-35.

[3]Thomas J D，Reeves P J，Salmond G P. The general secretion pathway of Erwinia carotovora subsp carotovora：Analysis of the membrane topology of OutC and OutF[J]. Microbiology，1997，143（3）：713-720.

[4]Arts J，De Groot A，Ball G，et al. Interaction domains in the Pseudomonas aeruginosa type Ⅱ secretory apparatus component XcpS （GspF）[J]. Microbiology （Reading，England），2007，153（Pt 5）：1582-1592.

[5]Abendroth J，Mitchell D D，Korotkov K V，et al. The three-dimensional structure of the cytoplasmic domains of EpsF from the type 2 secretion system of Vibrio cholerae[J]. Journal of Structural Biology，2009，166（3）：303-315.

[6]Peabody C R，Chung Y J，Yen M R，et al. Type Ⅱ protein secretion and its relationship to bacterial type Ⅳ pili and archaeal flagella[J]. Microbiology，2003，149（11）：3051-3072.

[7]Hayward A C. Biology and epidemiology of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum[J]. Annual Review of Phytopathology，1991，29：65-87.

[8]Altschul S F，Madden T L，Schffer A A，et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs[J]. Nucleic Acids Research，1997，25（17）：3389-3402.

[9]Rost B，Casadio R，F(xiàn)ariselli P，et al. Prediction of helical transmembrane segments at 95% accuracy[J]. Protein Science，1995，4（3）：521-533.

[10]Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al. MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution，2011，28（10）：2731-2739.

[11]Desvaux M，Parham N J，Scott-Tucker A，et al. The general secretory pathway：a general misnomer？[J]. Trends in Microbiology，2004，12（7）：306-309.

[12]Genin S，Boucher C. Ralstonia solanacearum：secrets of a major pathogen unveiled by analysis of its genome[J]. Mol Plant Pathol，2002，3（3）：111-118.

[13]Genin S，Boucher C. Lessons learned from the genome analysis of ralstonia solanacearum[J]. Annu Rev Phytopathol，2004，42：107-134.

[14]van Reenen C A，Dicks L M. Horizontal gene transfer amongst probiotic lactic acid bacteria and other intestinal microbiota：what are the possibilities？ A review[J]. Archives of Microbiology，2011，193（3）：157-168.

[15]Chial M，Ghysels B，Beatson S A et al. Identification of type Ⅱ and type Ⅲ pyoverdine receptors from Pseudomonas aeruginosa[J]. Microbiology，2003，149（4）：821-31.