桑青枯雷爾氏菌MR111的GspF基因的獲取與結構分析

楊金宏

摘要：GspF是細菌Ⅱ型分泌系統的內膜平臺的重要蛋白，利用PCR擴增技術，獲得了桑青枯雷爾氏菌MR111的含有該類基因功能性結構域的GspF基因。NCBI在線BLASTP分析發現，該基因與雷爾氏菌屬來源的同源基因的一致性在90%以上；在聚類分析中，首先所有雷爾氏菌屬同源基因聚合在同一分支，后與皮氏羅爾斯頓菌的同源基因聚合。基因結構分析表明，該基因有2個由α螺旋組成的具有高度相似性的、跨膜胞質結構域，揭示該基因可能參與細菌的跨膜分泌。

關鍵詞：桑青枯雷爾氏菌；Ⅱ型分泌系統；GspF基因；結構分析

中圖分類號：S888.71+1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0038-03

植物致病細菌Ⅱ型分泌系統（T2SS）是由12～15個分泌途徑轉膜蛋白（GSP）基因簇為中心組成的復合體，向細胞外分泌毒性因子、胞外酶、毒素等許多重要的蛋白質，通過2步將蛋白從細胞內轉移到細胞外[1]。GspF、GspL、GspM、GspE等共同組成T2SS的內膜平臺，組裝其他分泌元件，控制分泌通道的開啟[2]。GspF是內膜平臺中具有重要作用、并具有廣泛分布的胞質膜蛋白，Thomas等通過分析GspF的氨基酸序列，結合歐文氏桿菌（Erwinia carotovora）的GspF與BlaM融合試驗證實GspF穿過內膜3次，其N末端和C末端分別位于細胞質和周質[3]。2007年Arts等進一步通過堿性磷酸酶融合試驗證實了綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）中GspF的同源物的拓撲結構，證實了GspF是一個質膜蛋白[4]。2009年，Abendroth等對來自霍亂弧菌（Vibrio cholerae）的EpsF（GspF的同源基因）的N末端的胞質結構域的晶體結構進行了解析，其由6個反向平行α螺旋組成。2個分子EpsF蛋白的N-末端結構域形成1個緊密的二聚體并具有保守的結合界面[5]。Peabody等對大量來自細菌的GspF基因序列的分析表明，所有基因類似，且其2個胞質結構域是內部重復序列[6]。

植物青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的是一種具有嚴重危害的土傳性病害[7]，本研究以桑青枯雷爾氏菌為研究對象，獲得了桑青枯雷爾式菌的GspF基因的序列，并分析了其結構特征，為進一步研究桑青枯雷爾氏菌Ⅱ型分泌系統的基因功能和泌出機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

桑青枯雷爾氏菌MR111由陜西省蠶桑重點實驗室分離培養并保存。細菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）購自天根生化科技（北京）有限公司。dNTPs、EX Taq DNA聚合酶等為寶生物工程（大連）有限公司產品。培養桑青枯雷爾氏菌用的TTC固體培養基和SPA液體培養基等相關試劑均為分析純，自行配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 桑青枯雷爾氏菌MR111的活化與培養 超低溫冰箱取出保存的桑青枯雷爾氏菌，劃線于高壓滅菌的TTC培養基，于26 ℃恒溫培養箱中培養過夜，活化菌株。挑取TTC培養基生長的單菌落于SPA培養基，繼續置于26 ℃恒溫振蕩培養過夜。

1.2.2 桑青枯雷爾氏菌基因組DNA的提取與GspF基因的PCR擴增 收集培養過夜的桑青枯雷爾氏菌MR111，按細菌基因組DNA提取試劑盒說明提取基因組DNA，并以此為模板，以設計的GspF基因的PCR擴增引物（F：5′-CGATATGCCAGCCTTCC-3′；R：5′-CGTGACCTGTTGT-TTGA-3′）進行PCR反應，由于Gsp基因簇的GC含量相對較高（約70%），擴增體系中同時加入5%二甲基亞砜（DMSO），擴增桑青枯雷爾氏菌的GspF基因。使用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測PCR擴增產物，并將PCR擴增產物送上海生工武漢測序部進行測序。

1.2.3 GspF基因序列的分析 NCBI在線BLAST比對桑青枯雷爾氏菌MR111的GspF基因序列[8]，結合Rost等的方法[9]，分析基因編碼氨基酸的結構域，并下載其他同源基因序列，進行序列的比對和結構的分析。

2 結果與分析

2.1 桑青枯雷爾氏菌MR111的GspF基因序列的獲取

以提取的桑青枯雷爾氏菌的基因組DNA為模板，GspF基因擴增引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，結果在1 000 bp上方獲得單一擴增條帶（圖1）。回收該條帶并進行測序，獲得GspF基因121 bp 至終止密碼子后49個堿基共1 138 bp的序列（GenBank登錄號：KM115545）。

NCBI在線分析基因編碼氨基酸，結果表明同其他基因一樣，GspF編碼的氨基酸有2個具有高度保守性的T2SF

（pfam00482）結構、GspF（TIGR02120）結構以及T2SS系統的組分GspF的典型結構PulF（COG1459）（圖2）。

2.2 GspF基因的比對與聚類分析

NCBI在線BLASTP比對分析，GspF基因與其他來源青枯雷爾氏菌、皮氏羅爾斯頓氏菌（Ralstonia pickettii）等雷爾氏菌屬（Ralstonia sp.）的其他菌株的同源區域的一致性在90%以上，與伯克氏菌屬（Cupriavidus sp.）、伯克霍爾氏菌（Burkholderia sp.）等的相似性在均在80%以上。MEGA 5.0軟件[10]構

建GspF基因的NJ系統發育樹，結果如圖3所示。所有青枯雷爾氏菌的GspF基因聚合后與雷爾氏菌屬和羅爾斯頓氏菌的同源基因聚合在一起，而伯克霍爾氏菌單獨位于樹的最遠分支，這與傳統分類一致。

2.3 GspF基因結構的分析

V. cholerae的EpsF基因的胞質結構域已通過晶體結構進行解析，本研究結合BLAST比對和Rost等的方法[8-9]分析基因結構，結果2個基因的2個胞質結構域的相似性均在80%以上（圖4-A、B），GspF的前后2個胞質結構域間的相似性也在50%以上（圖4-C），基因的C端、N端都具有6個α螺旋，Met（171）、 Val（192）之間具有跨膜螺旋結構。這與Peabody等分析的2個胞質結構域是內部重復序列一致[6]。

3 討論與結論

革蘭氏陰性菌中，細菌的跨膜分泌蛋白占細胞總蛋白的20%，與細菌毒素分泌到胞、表達細胞表面的膜蛋白等生命活動有關[11]。目前已經在革蘭氏陰性菌中發現7種蛋白分泌機制，其中Ⅱ型分泌系統在革蘭氏陰性細菌中廣泛存在，該分泌系統以轉膜蛋白GSP基因簇為中心，突變會造成許多蛋白分泌的缺乏[12-13]。本研究獲得的桑青枯雷爾氏菌的GspF是具有廣泛分布的胞質膜蛋白，BLAST軟件分析GspF（EspF）基因間具有高度的相似性，MR111的GspF基因與其他來源青枯雷爾氏菌、皮氏羅爾斯頓氏菌以及雷爾氏菌屬的其他菌株的同源區域的一致性在90%以上。基于該基因進行聚類分析，所有雷爾氏菌屬聚合后再與羅爾斯頓氏菌的同源基因聚合，伯克霍爾氏菌單獨位于樹的最遠分支，說明GspF基因的進化與細菌的進化是一致的，沒有經歷基因的水平轉移[14]。

作為組成T2SS內膜平臺的蛋白之一，GspF基因存在于所有的T2SS分泌系統中[1，15]，V. cholerae的基因EspF的二級結構中存在6個反向平行螺旋，形成具有多個α螺旋構成的跨膜區，把疏水基團放在骨架外側，而親水基團位于螺旋內側，與有疏水性的脂雙層結構的細胞膜融合，實現穿過細胞膜的分泌[5]。EspF與GspF形成α螺旋的胞質結構域內的相似性在80%以上，GspF的2個胞質結構域也具有50%以上相似性，均體現了作為分泌系統的重要組成基因在基因序列和結構上的保守性。

本研究通過PCR技術獲得了桑青枯雷爾式菌MR111的GspF基因，并分析了基因間的相似性和結構特征，為進一步研究該菌的分泌機制奠定了基礎。〗

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