平陽(yáng)霉素化療對(duì)口腔鱗癌bcl－xl、Bak蛋白表達(dá)的影響

張永寬，薛振恂，王興強(qiáng)，王維璽，荊歡歡

平陽(yáng)霉素是廣泛用于治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的化療藥物，有效率較高，但也有很多的不良反應(yīng)。在臨床工作中，有的患者接受了大劑量的平陽(yáng)霉素治療，但化療效果卻不佳，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性。因此，研究平陽(yáng)霉素對(duì)口腔鱗癌化療的耐藥機(jī)制，具有很重要的意義。bcl－xl及Bak基因口腔癌中重要的凋亡調(diào)控基因，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及多耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)。本研究檢測(cè)平陽(yáng)霉素對(duì)口腔鱗癌bcl－xl及Bak蛋白表達(dá)水平的影響，探討平陽(yáng)霉素對(duì)口腔鱗癌化療的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)及分組 納入標(biāo)準(zhǔn)：①接受平陽(yáng)霉素術(shù)前誘導(dǎo)化療的口腔鱗癌病例；②患者接受平陽(yáng)霉素化療前未接受過(guò)其他化療或放療。

病例分組：按WHO化療療效標(biāo)準(zhǔn)分為：①有效組：完全緩解（CR：腫瘤完全消失）和部分緩解（PR：腫瘤最大直徑及其最大的垂直橫徑的乘積縮小50%以上）；②無(wú)效組：穩(wěn)定（SD）：腫瘤兩徑乘積縮小不足50%或增大不足25%，進(jìn)展（PD）：腫瘤兩徑乘積增大超過(guò)25%或出現(xiàn)新病灶。無(wú)效組作為對(duì)照組。

根據(jù)上述條件篩選出用藥前后的標(biāo)本蠟塊每組均為20對(duì)，用藥前后的同一患者的蠟塊標(biāo)本為一配對(duì)樣本。

1.2 一般資料 取自第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院及解放軍第150中心醫(yī)院病理科，共40例。有效組：20 例，其中男 11 例，女 9 例；年齡（54.5±6.4）歲；體質(zhì)量（61.3±4.0） kg；部位：頰黏膜 1 例，舌部 5 例，牙齦11例，腭部2例，唇部1例；病理分級(jí)：Ⅰ級(jí)13例，Ⅱ級(jí)7例；生長(zhǎng)方式：外生型17例，潰瘍型3例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期11例，Ⅲ～Ⅳ期9例；給藥方式：肌肉注射12例，靜脈注射8例；最終劑量（165±60）mg。 無(wú)效組：20例，其中男 13例，女 7例；年齡（55.3±5.3）歲；體質(zhì)量（60.6±6.3） kg；部位：頰黏膜 3例，舌部8例，牙齦6例，腭部3例；病理分級(jí)：Ⅰ級(jí)11例，Ⅱ級(jí)9例；生長(zhǎng)方式：外生型15例，浸潤(rùn)型2例，潰瘍型3例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期10例，Ⅲ～Ⅳ期10例；給藥方式：肌肉注射13例，靜脈注射7例；最終劑量（147±63） mg。

1.3 主要試劑與儀器 兔抗人bcl－xl多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；兔抗人Bak多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；免疫組化SABC試劑盒 （武漢博士德生物工程有限公司）；微波爐（格蘭仕公司）；石蠟切片機(jī)（AO820德國(guó)）；光學(xué)顯微鏡 （OLYMPUS日本）；顯微照相系統(tǒng)（OLYMPUS 日本）。

1.4 免疫組化染色步驟

1.4.1 bcl－xl染色步驟 按照博士德公司 SABC免疫組化試劑盒的步驟操作：切片經(jīng)二甲苯脫蠟后梯度乙醇溶液水化，3%過(guò)氧化氫消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性（37℃，10 min），用微波法進(jìn)行抗原修復(fù)（95～100 ℃，15 min）， 自然冷卻后 PBS 洗 5 min×3次，用10%正常山羊血清封閉（37℃，20 min），滴加1∶50 的兔抗人 bcl－xl一抗。4℃過(guò)夜后 37℃復(fù)溫 1h，PBS 5 min×3次，然后滴加1∶100的生物素標(biāo)記二抗（37 ℃，20 min），PBS 洗 5 min×3 次，滴加 1∶100 的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素（37℃，20 min），PBS洗5 min×4次，DAB顯色劑顯色10 min后終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水透明，封片。陰性對(duì)照：用PBS代替一抗工作液。

1.4.2 BAK染色步驟 按照博士德公司SABC免疫組化試劑盒的步驟操作：切片經(jīng)二甲苯脫蠟后梯度乙醇溶液水化，3%過(guò)氧化氫消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性 （37℃，10 min）， 胰蛋白酶抗原修復(fù)（0.1%，pH 7.8，37 ℃，10 min），PBS 洗 5 min×3 次，用10%正常山羊血清封閉 （37℃，20 min）， 滴加1∶50的兔抗人BAK一抗。4℃過(guò)夜后37℃復(fù)溫1 h，PBS洗5 min×3次，然后滴加1∶100的生物素標(biāo)記二抗（37 ℃，20 min），PBS 洗 5 min×3 次，滴加 1∶100 的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素（37℃，20 min），PBS洗5 min×4次，DAB顯色劑顯色10 min后終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水透明，封片。陰性對(duì)照：用PBS代替一抗工作液。

1.5 分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用顯微鏡觀察結(jié)果，隨機(jī)取五個(gè)視野，記數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞率及染色強(qiáng)度，然后按下列方法計(jì)算該切片的積分：陽(yáng)性細(xì)胞比例積分：0～4% ：0，5%～25% ：1，26%～50% ：2，51%～75% ：3，76%～100%：4。染色強(qiáng)度積分：陰性：0，弱陽(yáng)性：1，中度陽(yáng)性：2，強(qiáng)陽(yáng)性：3。記分方法：如一切片中有20%強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞，35%中度陽(yáng)性細(xì)胞，10%弱陽(yáng)性細(xì)胞，其積分為：陽(yáng)性率20%時(shí)的積分1×強(qiáng)陽(yáng)性積分3＋陽(yáng)性率35%時(shí)的積分2×中度陽(yáng)性積分2＋陽(yáng)性率10%時(shí)的積分1×若陽(yáng)性積分1＝8。每一對(duì)數(shù)據(jù)為一配對(duì)資料，用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 均衡性檢驗(yàn) 有效組和無(wú)效組患者在年齡、體重、給藥方式及總劑量等方面未見(jiàn)顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 平陽(yáng)霉素對(duì)有效組標(biāo)本中 bcl－xl、Bak蛋白表達(dá)的影響

2.2.1 平陽(yáng)霉素對(duì) bcl－xl蛋白表達(dá)的影響 在治療前的標(biāo)本中，bcl－xl蛋白表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性的為9例，中度陽(yáng)性的為6例，弱陽(yáng)性為3例，陰性為2例。而治療后的標(biāo)本中可見(jiàn)bcl－xl蛋白表達(dá)明顯降低，中度陽(yáng)性為10例，弱陽(yáng)性為6例，陰性為4例。用SPSS19.0進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)后認(rèn)為具有顯著性差異（P＜0.01）。

2.2.2 平陽(yáng)霉素對(duì)Bak蛋白表達(dá)的影響 治療前的標(biāo)本中，有4例為強(qiáng)陽(yáng)性，7例為中度陽(yáng)性，8例為弱陽(yáng)性，1例為陰性。在治療后的標(biāo)本中，有5例為強(qiáng)陽(yáng)性，9例為中度陽(yáng)性，4例為弱陽(yáng)性，2例為陰性。用SPSS19.0進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果為治療前后無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 平陽(yáng)霉素對(duì)無(wú)效組標(biāo)本中 bcl－xl、Bak蛋白表達(dá)的影響

2.3.1 平陽(yáng)霉素對(duì)無(wú)效組標(biāo)本中 bcl－xl蛋白表達(dá)的影響 在治療前的標(biāo)本中，bcl－xl蛋白表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性的為7例，中度陽(yáng)性的為8例，弱陽(yáng)性為4例，陰性為1例。而治療后的標(biāo)本中強(qiáng)陽(yáng)性的為6例，中度陽(yáng)性為10例，弱陽(yáng)性為2例，陰性為2例。用SPSS19.0進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果認(rèn)為治療前后無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.3.2 平陽(yáng)霉素對(duì)無(wú)效組標(biāo)本中Bak蛋白表達(dá)的影響 治療前的標(biāo)本中，有3例為強(qiáng)陽(yáng)性，6例為中度陽(yáng)性，7例為弱陽(yáng)性，4例為陰性。在治療后的標(biāo)本中，有4例為強(qiáng)陽(yáng)性，8例為中度陽(yáng)性，5例為弱陽(yáng)性，3例為陰性。用SPSS19.0進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果認(rèn)為治療前后無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

3 討 論

bcl－2蛋白家族在調(diào)節(jié)細(xì)胞程序性死亡中起到中樞作用，包括抑制凋亡和促進(jìn)凋亡成員。抑制凋亡有 bcL－2、bcl－xL、bcl－w、mcl－1，促進(jìn)凋亡有 Bax、Bak、Bik、Noxa 及 Bim。 bcl－xL 是 bcl－2 基因家族的重要成員，是高度保守的基因，它可通過(guò)不同的剪接機(jī)制產(chǎn)生兩個(gè)大小不同、作用相反的mRNA。其中長(zhǎng)型 mRNA（bcl－xl）編碼 223 個(gè)氨基酸殘基，比短型mRNA（bcl－xs）編碼的氨基酸多63個(gè)，而這63個(gè)氨基酸與bcl－2蛋白有73%的同源區(qū)域，bcl－xl蛋白的功能與bcl－2相似，能與Bax、Bak等蛋白形成異二聚體，中和Bax、Bak的促凋亡作用，從而抑制細(xì)胞凋亡。bcl－xl是獨(dú)立于bcl－2蛋白以外的抑制凋亡的蛋白，與bcl－2蛋白具有拮抗性的表達(dá)。bcl－xl在長(zhǎng)壽命的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，有文獻(xiàn)報(bào)道bcl－xl是口腔鱗癌中表達(dá)的主要抑凋亡蛋白［1］。

Bak是bcl－2基因家族Bax亞系的又一促凋亡基因，它編碼一個(gè)由216個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，與 bcl－2 蛋白有 28%的同源性，含有 BH1、BH2、BH3 功能區(qū)，BH3 是連接 bcl－2、bcl－xl的部分，被認(rèn)為是死亡配體，能與bcl－2、bcl－xl結(jié)合后影響其下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。它能與bcl－2、bcl－xl形成異二聚體，與 bcl－xl聚合的作用更強(qiáng)，從而中和 bcl－2、bclxl的抑凋亡作用， 也能不依賴于與 bcl－2、bcl－xl形成異二聚體的作用而獨(dú)自發(fā)揮促凋亡的作用［2］。

目前有研究表明化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡伴隨著bcl－2基因家族表達(dá)的改變，通過(guò)改變?cè)摷易甯骰虮磉_(dá)的平衡來(lái)影響細(xì)胞凋亡。Jones等［3］研究發(fā)現(xiàn)順鉑誘導(dǎo)的卵巢細(xì)胞癌A2780細(xì)胞凋亡伴隨著B(niǎo)ak蛋白表達(dá)水平的上調(diào)，Liu等［4］發(fā)現(xiàn)用紫杉醇誘導(dǎo)前列腺癌LNCaP細(xì)胞的凋亡伴隨著bcl－xl mRNA和蛋白表達(dá)的下調(diào)和Bak蛋白的上調(diào)，Christensen等［5］研究凋亡調(diào)控機(jī)制時(shí)用博來(lái)霉素作用于肝細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡伴隨著 bcl－2、bcl－xl蛋白表達(dá)的下調(diào)，及 p53、Bak、Bax蛋白表達(dá)的上調(diào)。Zhao等［6］的研究表明，苦丁茶多酚在體外能顯著誘導(dǎo)BcaCD885腫瘤細(xì)胞的凋亡，并能上調(diào) caspase－3、caspase－8、caspase－9、Fas/FasL、Bax、p53、p21、E2F1、p73 和 下 調(diào) bcl－2、bclxL、HIAP－1、HIAP－2 基因及蛋白的表達(dá)。Luo 等［7］研究二甲雙胍對(duì)口腔鱗癌的作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能顯著下調(diào)bcl－2和bcl－xL蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)。

該研究通過(guò)對(duì)平陽(yáng)霉素治療前后的兩組口腔鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本的免疫組織化學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)有效組中平陽(yáng)霉素能使口腔鱗癌細(xì)胞中bcl－xl蛋白的表達(dá)下調(diào)，對(duì)Bak蛋白的表達(dá)沒(méi)有影響。而對(duì)無(wú)效組中的bcl－xl、Bak蛋白的表達(dá)沒(méi)有影響。有研究證明bcl－xl的蛋白表達(dá)水平和其mRNA水平具有顯著的相關(guān)性［8］，因此，平陽(yáng)霉素是否能使 bcl－xl的mRNA的表達(dá)也相應(yīng)下調(diào)，尚需進(jìn)一步研究證明。

bcl－xl能夠保護(hù)由 p53 介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡［9］。很多細(xì)胞凋亡誘發(fā)因素能使線粒體外膜斷裂，而線粒體外膜的不連續(xù)導(dǎo)致細(xì)胞色素C由線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，線粒體上的bcl－xl蛋白能阻止細(xì)胞色素C的釋放，并能使細(xì)胞通過(guò)阻止線粒體膜的電位下降適應(yīng)生長(zhǎng)因子去除或藥物的作用［10］。從而抑制細(xì)胞的凋亡。而且bcl－xl蛋白能直接特異性的與細(xì)胞色素C結(jié)合，bcl－xl蛋白高表達(dá)的細(xì)胞中的細(xì)胞色素C減少。通過(guò)阻止細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞色素C的有效性，bcl－xl蛋白能有效地阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生［11］。有關(guān)實(shí)驗(yàn)表明：bcl－xl能有效地增強(qiáng)腫瘤對(duì)化療藥物的耐受性［12］，有人用反義 bcl－xl核酸下調(diào) bcl－xl的表達(dá)，來(lái)提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性［13］。而本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明：平陽(yáng)霉素在化療過(guò)程中顯著地降低了bcl－xl蛋白的表達(dá)，可能降低了腫瘤對(duì)化療藥物的耐受性，因此導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。

該研究結(jié)果表明有效組中平陽(yáng)霉素能有效地下調(diào)bcl－xl蛋白的表達(dá)水平，可能誘導(dǎo)了口腔癌細(xì)胞的凋亡，是否是平陽(yáng)霉素對(duì)口腔鱗癌化療的機(jī)制之一，還需要進(jìn)一步研究。

［1］ Schoelch M，Le Q，Silverman S，et al.Apoptosis－associated proteins and the development of oral squamous cell carcinoma［J］.Oral Oncol，1999，35（1）：77－85.

［2］ Simonian P，Grillot D，Nunez G.Bak can accelerate chemotherapy－induced cell death independently of its heterodimerization with bcl－xl and bcl－2［J］.Oncogene，1997，15（15）：1871－1875.

［3］ Jones N，Turner J，Mcilwrath A，et al.Cisplatin－and paclitaxelinduced apoptosis of ovarian carcinoma cells and the relationship between bax and Bak up－regulation and the functional status of p53［J］.Mol Pharmacol，1998，53（5）：819－826.

［4］ Liu Q，Stein C.Taxol and estramustine－induced modulation of human prostate cancer cell apoptosis via alteration in bcl－xl and Bak expression［J］.Clin Cancer Res，1997，3（11）：2039－2046.

［5］ Christensen J，Gonzales A，Cattley R，et al.Regulation of apoptosis in mouse hepatocytes and alteration of apoptosis by nongenotoxic carcinogens［J］.Cell Growth Differ，1998，9（8）：815－825.

［6］ Zhao X，Pang L，Li J，et al.Apoptosis inducing effects of Kuding tea polyphenols in human buccal squamous cell carcinoma cell line BcaCD885［J］.Nutrients，2014，6（8）：3084－3100.

［7］ Qingqiong Luo，Dan Hu，Shuiqing Hu，et al.In vitro and in vivo anti－tumor effect of metformin as a novel therapeutic agent in human oral squamous cell carcinoma［J］.BMC Cancer，2012，12（5）：517－526.

［8］ Marone M，Scambia G，Mozzetti S，et al.bcl－2，Bax，bcl－xl，and bcl－xs expression in normal and neoplastic ovarian tissues［J］.Clin Cancer Res，1998，4（5）：517－524.

［9］ Schott A，Apel I，Nunez G，et al.Bcl－xl protects cancer cells from p53－mediated apoptosis［J］.Oncogene，1995，11（7）：1389－1394.

［10］ Vander H，Chandel N，Williamson E，et al.Bcl－xl regulates the membrane potenial and volume homeostasis of mitochondria［J］.Cell，1997，91（5）：627－637.

［11］ Kharbanda S，Pandey P，Schofield L，et al.Role for Bcl－xl as an inhibitor of cytosolic cytochrome C accumulation in DNA damage－induced apoptosis［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（13）：6939.

［12］ Noutomi T，Chiba H，Itoh M，et al.Bcl－x（L） confers multidrug resistance in several squamous cell carcinoma cell lines［J］.Oral Oncol，2002，38（1）：41－48.

［13］ Itoh M，Noutomi T，Chiba H，et al.BcI－xL antisense treatment sensitizes Bcl－xL－overexpressing squamous cell carcinoma cells to carboplatin［J］.Oral Oncol，2002，38（8）：752－756.