我國(guó)藥用植物原生質(zhì)體培養(yǎng)的研究進(jìn)展

尹紅新　雷秀娟　宋娟等

摘要：對(duì)近年來(lái)藥用植物原生質(zhì)體的制備、培養(yǎng)、融合以及植株再生進(jìn)行了綜述，闡明了起始材料、酶解條件、培養(yǎng)方法等對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響，并對(duì)今后藥用植物原生質(zhì)體的重點(diǎn)研究方向作了討論。

關(guān)鍵詞：藥用植物；原生質(zhì)體；酶解條件；培養(yǎng)；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)：Q942 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）03-0243-03

原生質(zhì)體（protoplast）是指植物細(xì)胞中除去細(xì)胞壁后有生命活性的部分，除去細(xì)胞壁的原生質(zhì)體能夠直接攝入外源的細(xì)胞器、DNA、病毒、質(zhì)粒等，是進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化研究的理想受體，對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞融合可獲得雜種細(xì)胞[1]。因此，植物原生質(zhì)體在品種改良和生物學(xué)基礎(chǔ)理論研究中有廣泛的應(yīng)用前景，備受國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者的關(guān)注。1892年，Klercker首次用機(jī)械法進(jìn)行原生質(zhì)體的分離研究，但是原生質(zhì)體獲得量很少[2]。1960年，Cocking采用酶解法從高等植物細(xì)胞中分離獲得原生質(zhì)體[3]。隨著纖維素酶和果膠酶的推行，植物原生質(zhì)體培養(yǎng)逐漸成為一個(gè)熱門話題[4]。1971年，Takebe等首次從煙草葉片中分離出原生質(zhì)體并獲得再生植株，原生質(zhì)體的培養(yǎng)進(jìn)入一個(gè)新的階段[5]。在此基礎(chǔ)上，藥用植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)也有了一定的發(fā)展。目前，藥用植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)已經(jīng)擴(kuò)展到夾竹桃科、五加科、紫草科、菊科、龍膽科、葫蘆科、茄科、玄參科、天南星科等數(shù)十科。本文就近年來(lái)藥用植物原生質(zhì)體的制備、培養(yǎng)、融合以及植株再生進(jìn)行綜述，為今后藥用植物原生質(zhì)體培養(yǎng)的研究尋求切入點(diǎn)和突破點(diǎn)，提供新的研究方法和有力的論證依據(jù)。

1 原生質(zhì)體的分離

原生質(zhì)體分離是進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)的第1步，直接影響原生質(zhì)體培養(yǎng)能否成功。其中，原始材料的生理狀態(tài)，原生質(zhì)體的分離、預(yù)處理方法以及游離純化方法等都是影響原生質(zhì)體分離的重要因素。原生質(zhì)體的分離方法主要有機(jī)械法和酶解法2種。機(jī)械法存在產(chǎn)量低等缺陷，因此多采用酶解法進(jìn)行原生質(zhì)體的分離。

1.1 原始材料的選擇

原始材料及其生理狀態(tài)對(duì)原生質(zhì)體的制備及其活力有很大的影響[6]。生長(zhǎng)旺盛、生命力強(qiáng)的組織和細(xì)胞是獲得高活性原生質(zhì)體的關(guān)鍵，并對(duì)原生質(zhì)體的復(fù)壁、愈傷組織的形成以及植株再生有重要的影響。原生質(zhì)體分離的原始材料有很多，只要選用的酶類型及用量合適，就可以在植物的任何部位獲得游離的原生質(zhì)體[2]。據(jù)有關(guān)原生質(zhì)體培養(yǎng)的報(bào)道，葉片是分離原生質(zhì)體試驗(yàn)中常用的原始材料[7]。張曉麗等以青天葵新鮮葉片為試驗(yàn)材料獲得制備青天葵原生質(zhì)體的理想條件與參數(shù)[8]。愈傷組織和懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)迅速穩(wěn)定，受環(huán)境條件影響比較小，更易獲得大量高質(zhì)量的原生質(zhì)體。但是，長(zhǎng)期培養(yǎng)的愈傷組織和懸浮細(xì)胞容易引起植株喪失再生能力，這就須要選擇胚性狀態(tài)的細(xì)胞團(tuán)，這是再生植株所必需的[9-10]。同時(shí)，基因型也會(huì)影響植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)，不同基因型分離得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力差別很大[11]，并且對(duì)原生質(zhì)體的植株再生也有一定的影響[12]。

1.2 原始材料的預(yù)處理

一些研究表明，材料的預(yù)處理對(duì)保持原生質(zhì)體的完整性及提高原生質(zhì)體產(chǎn)量有積極的作用。張曉麗等用13%甘露醇溶液預(yù)處理青天葵葉片1 h，獲得大量的原生質(zhì)體[8]。王鵬凱等以北美鵝掌楸的懸浮細(xì)胞和組培苗葉片為材料，用含有0.1% 2-嗎啉乙磺酸（MES）和0.6 mol/L甘露醇的Cell Protoplast Wash （60M-CPW）溶液25 ℃預(yù)處理 1 h，結(jié)果顯示原生質(zhì)體產(chǎn)量明顯提高[13]。于相麗等以洛陽(yáng)紅牡丹葉片為材料制備原生質(zhì)體，在蔗糖濃度為0.3 mol/L的溶液中預(yù)處理0.5 h的效果最好[14]。但是，并不是所有的原生質(zhì)體分離都需要經(jīng)過(guò)預(yù)處理，要根據(jù)不同的情況而定。

1.3 原生質(zhì)體的分離方法

藥用植物游離原生質(zhì)體常用的酶有纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、離析酶等，不同植物材料選用哪種酶較好取決于所用細(xì)胞和組織的來(lái)源。不同種類酶的混合使用和精確的酶解溫度和酶解時(shí)間的設(shè)置，可以得到較好的酶解效果[15-16]。近年來(lái)，開(kāi)發(fā)一種微生物型的纖維素酶和果膠酶用于原生質(zhì)體分離逐漸成為討論的焦點(diǎn)[17]。

滲透壓是影響原生質(zhì)體游離的一個(gè)重要因素。滲透壓過(guò)低，原生質(zhì)體缺乏細(xì)胞壁的保護(hù)，往往會(huì)出現(xiàn)破裂的情況。有研究表明，微高的滲透壓有利于原生質(zhì)體維持穩(wěn)定的形態(tài)[18]。滲透壓穩(wěn)定劑是酶液的重要組成部分，應(yīng)當(dāng)引起足夠的重視。藥用植物原生質(zhì)體分離環(huán)境中常用的滲透壓穩(wěn)定劑為甘露醇和山梨醇[19-20]，甘露醇由于在試驗(yàn)中的降解性小于山梨醇而被認(rèn)為是目前最適合的滲透壓穩(wěn)定劑。

1.4 原生質(zhì)體游離基純化方法

原生質(zhì)體游離后的提純方法常用的有漂浮法和沉降界面法，其中沉降界面法使原生質(zhì)體集中在兩相界面，操作簡(jiǎn)單，但是容易造成原生質(zhì)體損傷；漂浮法在重復(fù)漂浮洗滌純化的過(guò)程中對(duì)原生質(zhì)體的損傷較小，但是容易混進(jìn)一些不需要的原液，影響漂浮純化效果，這就須要嚴(yán)格控制離心力[21]。

2 原生質(zhì)體的培養(yǎng)

2.1 培養(yǎng)基

在藥用植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)中，常用的培養(yǎng)基有改良的MS、B5、KM8P、6，7-V、V-KM等培養(yǎng)基[22-25]，培養(yǎng)基的pH值一般為5.6～5.8。無(wú)機(jī)鹽是構(gòu)成培養(yǎng)基的主要成分，一般Ca2+和NH+4對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)效果影響較大，且較高濃度的Ca2+有利于原生質(zhì)體培養(yǎng)[26]。馬鋒旺等在原生質(zhì)體培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，高濃度的NH+4能抑制原生質(zhì)體分裂[27-28]。原生質(zhì)體洗液（CPW）中鹽離子的濃度和種類對(duì)原生質(zhì)體細(xì)胞膜的穩(wěn)定性也有一定的影響，試驗(yàn)中應(yīng)注意[29]。

一定水平的滲透壓可以保持原生質(zhì)體的正常形態(tài)，使原生質(zhì)體的正常生理功能得以進(jìn)行，培養(yǎng)基中的碳源和滲透劑在原生質(zhì)體培養(yǎng)中有重要的作用。衛(wèi)志明等研究發(fā)現(xiàn)，使用葡萄糖可以提高懸鈴木葉肉原生質(zhì)體的植板率[30]。林順權(quán)等在對(duì)枇杷原生質(zhì)體的研究中發(fā)現(xiàn)，10%葡萄糖+5%山梨醇是所有試驗(yàn)處理中最合適的碳源兼滲透劑[31]。endprint

2.2 培養(yǎng)方法

原生質(zhì)體常用的培養(yǎng)方法包括液體淺層培養(yǎng)、固-液雙層培養(yǎng)、瓊脂糖包埋及看護(hù)培養(yǎng)等方法，目前應(yīng)用最廣泛的是固-液雙層培養(yǎng)。范小峰等以南蛇藤胚性愈傷組織為材料分離原生質(zhì)體，采用液體淺層靜置培養(yǎng)并取得了較好的原生質(zhì)體培養(yǎng)效果[32]。秦曉杰等在胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行原生質(zhì)體的懸滴培養(yǎng)、液體培養(yǎng)等不同培養(yǎng)方式的研究，結(jié)果表明看護(hù)培養(yǎng)是最佳培養(yǎng)方法[22]。這些常用的原生質(zhì)體培養(yǎng)方法同樣適用于藥用植物原生質(zhì)體培養(yǎng)。

不同類型的藥用植物應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況采用不同的培養(yǎng)方式，一些植物也可采用多種培養(yǎng)方式聯(lián)合培養(yǎng)。其中，五加科、天南星科等較適合液體淺層和固-液雙層的聯(lián)合培養(yǎng)方式[24，33]，菊科、傘形科的植株較適合固體的培養(yǎng)方式[2，34]，茄科、玄參科植株較適合液體淺層培養(yǎng)方式[35-36]。

3 原生質(zhì)體的融合

由于植物原生質(zhì)體沒(méi)有細(xì)胞壁的限制，它為體細(xì)胞遺傳研究和作物改良提供了許多方便[37]。傳統(tǒng)的有性雜交存在遠(yuǎn)緣雜交不親和、雙親花期不遇、雌（雄）不育等難以克服的障礙，嚴(yán)重阻礙了雜交技術(shù)在植物育種中的應(yīng)用。由于分離的原生質(zhì)體無(wú)細(xì)胞壁，可以用物理或化學(xué)方法誘導(dǎo)融合。利用植物原生質(zhì)體進(jìn)行細(xì)胞融合和體細(xì)胞雜交，可以克服有性雜交遇到的障礙。

自 Carlson等在 1972 年獲得第1株煙草體細(xì)胞雜種植株以來(lái)[38]，原生質(zhì)體融合技術(shù)在藥用植物中已廣泛應(yīng)用。早期原生質(zhì)體融合的方法主要有硝酸鈉法、高濃度Ca2+高 pH值法、PEG（聚乙二醇）法、PEG-高濃度Ca2+高pH值法、電融合法及聚集微束激光法等，目前廣泛使用的是PEG-高濃度 Ca2+高 pH 值法[39-40]和電融合法[41-42]。但是，PEG-高濃度 Ca2+高 pH值法存在融合頻率低的弱點(diǎn)。Chen等用該方法進(jìn)行原生質(zhì)體融合，融合頻率約45%[43]。近年來(lái)一些研究者發(fā)現(xiàn)，加入二甲基亞砜（DMSO）可以有效提高融合頻率[44]。電融合法操作簡(jiǎn)單、快速，融合同步性好，還可以避免化學(xué)藥劑的毒害作用，被大家普遍接受。

4 原生質(zhì)體的再生

在藥用植物原生質(zhì)體培養(yǎng)中，因?yàn)樵|(zhì)體培養(yǎng)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性差且經(jīng)驗(yàn)性很強(qiáng)，所以由原生質(zhì)體獲得愈傷組織的實(shí)例很多，但是成功獲得原生質(zhì)體再生植株的案例很少。目前，我國(guó)從藥用植物的原生質(zhì)體培養(yǎng)和花藥培養(yǎng)中獲得完整植株的物種有前胡、防風(fēng)、決明子、黨參、石刁柏、枸杞、毛葉曼陀羅等[45]。原生質(zhì)體再生植株的途徑通常有3種：由細(xì)胞團(tuán)形成愈傷組織，然后再分化成植株；直接形成胚狀體，再發(fā)育成植株；由細(xì)胞團(tuán)形成的愈傷組織先分化成胚狀體，然后發(fā)育成植株[1]。據(jù)目前一些研究結(jié)果來(lái)看，大多數(shù)植物再生植株以誘導(dǎo)器官發(fā)生途徑較多，而五加科和傘形科植物的最佳途徑是誘導(dǎo)體胚的發(fā)生[2]。

5 結(jié)論

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外廣泛地開(kāi)展了植物原生質(zhì)體的研究工作，植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和融合取得了突破性進(jìn)展，主要表現(xiàn)在通過(guò)原生質(zhì)體獲得再生植株的種類不斷增加。其中，藥用植物已經(jīng)從原來(lái)不能雜交的植物胡蘿卜和人參、曼陀羅和顛茄、煙草和龍葵等獲得雜種植株。

雖然藥用植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和融合取得很大進(jìn)展，但也存在一些缺陷，如再生植株遺傳性狀的穩(wěn)定性差；雜種植株發(fā)生變異的規(guī)律尚不明確；缺乏完整的藥用植物原生質(zhì)體培養(yǎng)體系，技術(shù)體系基本借鑒于其他植物且相對(duì)落后。這些都是藥用植物原生質(zhì)體研究以后需要重點(diǎn)解決的問(wèn)題。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉慶昌，吳國(guó)良. 植物細(xì)胞組織培養(yǎng)[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2003：178.

[2]林閱兵. 人參與胡蘿卜原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株的研究[D]. 長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[3]Cocking E C. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles[J]. Nature，1960，87：927-929.

[4]李凌明. 植物組織培養(yǎng)教程[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2002：190.

[5]張紅梅，王俊麗. 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)，2002，12（5）：44-45.

[6]金曉玲，何 平. 木本植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與融合研究進(jìn)展[J]. 浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，26（1）：54-59.

[7]Vardi A，Spiegel-Roy P，Galun E. Plant regeneration from citrus protoplast：variability in methodological requirements among cultivars and species[J]. Theor App Genet，1982，62：171-176.

[8]張曉麗，何 瑞，童家赟，等. 藥用植物青天葵葉片原生質(zhì)體的制備與純化[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（35）：21644-21646.

[9]沈前華，楊柏云，郭金平，等. 大花蕙蘭原生質(zhì)體分離的影響因素研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1996，8（1）：36-40.

[10]孫勇如，李文彬，黃美娟，等. 枸杞的原生質(zhì)體生成愈傷組織[J]. 植物學(xué)報(bào)，1982，5（5）：477-479.

[11]Nyman M，Wallin A. Plant regeneration from rawberry（Fragaria×ananssa） mesophyyll protoplasts[J]. Plant Physiology，1998，133：375-377.

[12]Esmlida H P，Otto S. Plant regeneration from leaf protoplasts of apple[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1993，34（1）：71-76.endprint

[13]王鵬凱，呂偉光，胡雪怡，等. 北美鵝掌楸原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2013，33（2）：254-260.

[14]于相麗，李勇慧，李 業(yè). 牡丹葉片原生質(zhì)體分離條件的研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，41（1）：122-125.

[15]趙小強(qiáng)，馬暉玲，林 棟，等. 草地早熟禾新格萊德胚性愈傷組織原生質(zhì)體培養(yǎng)及植株再生的研究[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（2）：55-60.

[16]蔡 肖，康向陽(yáng). 小青楊葉肉原生質(zhì)體分離條件的研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（10）：18-22.

[17]Gummadi S N，Pandon T. Purification and biochemical properties of microbial pectinases—a review[J]. Process Biochemistry，2002，38（7）：987-996.

[18]郭艷萍.玉米胚乳細(xì)胞原生質(zhì)體的分離與流式純化[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

[19]俞 超，楊 瀟，王忠華，等. 葡萄愈傷組織制備原生質(zhì)體的影響因素研究[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào)，2013，3（3）：433-436.

[20]王 昱，王 義，王康宇，等. 靈芝原生質(zhì)體的制備與再生研究[J]. 北方園藝，2013（16）：184-188.

[21]蒙愛(ài)東. 生物技術(shù)在藥用植物中的應(yīng)用[J]. 廣西醫(yī)學(xué)，2006，06（6）：789-791.

[22]秦曉杰，段華金，朱永平，等. 東方百合‘Sorbonne原生質(zhì)體培養(yǎng)初步研究[J]. 分子植物育種，2013，5（5）：600-604.

[23]姜淑慧，管榮展，董海濱，等. 播娘蒿與甘藍(lán)型油菜的原生質(zhì)體融合與植株再生[J]. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2005，27（4）：1-6.

[24]李樂(lè)工. 人參原生質(zhì)體培養(yǎng)再生愈傷組織[J]. 植物學(xué)報(bào)：英文版，1989，31（10）：815-816.

[25]劉艷麗. 盾葉薯蕷愈傷組織誘導(dǎo)與原生質(zhì)體培養(yǎng)[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[26]趙大克，王敬喬，陳 薇，等. 植物原生質(zhì)體獲得、培養(yǎng)條件及方法對(duì)其再生體系構(gòu)建的影響[J]. 云南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008（增刊2）：403-408.

[27]馬鋒旺，李嘉瑞. 山桃原生質(zhì)體培養(yǎng)再生愈傷組織[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1999，8（3）：73-76.

[28]羅建平，賈敬芬，顧月華，等. 沙打旺胚性原生質(zhì)體培養(yǎng)優(yōu)化及高頻再生植株[J]. 生物工程學(xué)報(bào)，2000，16（1）：17-21.

[29]王麗華，陳建華，李昌珠，等. 光皮樹(shù)花藥愈傷組織的誘導(dǎo)[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究，2011，29（1）：94-98.

[30]衛(wèi)志明，許智宏，許 農(nóng)，等. 懸鈴木葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株[J]. 植物學(xué)報(bào)：英文版，1991，33（11）：813-818，900.

[31]林順權(quán)，陳振光. 山梨醇對(duì)枇杷原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)的效應(yīng)[J]. 福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，26（4）：18-23.

[32]范小峰，李東波，劉靈霞，等. 南蛇藤原生質(zhì)體培養(yǎng)及植株再生[J]. 植物研究，2011，03（3）：300-305.

[33]高 利. 西洋參葉肉原生質(zhì)體的游離與培養(yǎng)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（23）：7194-7195.

[34]陳發(fā)棣，趙宏波，房偉民，等. 菊科植物原生質(zhì)體研究進(jìn)展[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2005，25（9）：1913-1920.

[35]曹有龍，許 興，宋玉霞，等. 枸杞原生質(zhì)體培養(yǎng)及高效成株體系的建立[J]. 植物學(xué)通報(bào)，2001，18（5）：605-614.

[36]孫雪梅. 馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，01（1）：134-136.

[37]朱至清. 植物細(xì)胞工程[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：150-167.

[38]Kao F T，Puck T T. Induction and isolation of auxotrophic mutants in mammalian cells[J]. Methods in Cell Biology，1974，8（0）：23-39.

[39]Varotto S，Nenz E，Lucchin M，et al. Production of asymmetric somatic hybrid plants between Cichorium intybus L. and Helianthus annuus L.[J]. Theoretical and Applied Genetics，2001，102（6/7）：950-956.

[40]杜雪竹，李再云. 甘藍(lán)型油菜與菘藍(lán)原生質(zhì)體融合及植株再生體系的研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（11）：2364-2368.

[41]孫玉強(qiáng). 棉花原生質(zhì)體培養(yǎng)和原生質(zhì)體對(duì)稱融合研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[42]徐小勇. 柑橘原生質(zhì)體融合及體細(xì)胞雜種核質(zhì)遺傳研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[43]Chen L P，Zhang M F，Li C S，et al. Production of interspecific somatic hybrids between tuber mustard （Brassica juncea） and red cabbage （Brassica oleracea）[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2005，80（3）：305-311.

[44]孫慧慧，王力軍，閆曉紅，等. 植物原生質(zhì)體融合培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（7）：118-122.

[45]李 杰，黃敏仁，王明庥，等. 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞融合技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，16（4）：64-71.endprint