白藜蘆醇誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞細(xì)胞凋亡及其與p38 MAPK信號(hào)途徑的聯(lián)系

華叢書(shū)，陳　海，張朝東，趙　歡，陳曉宇

◇藥學(xué)研究◇

白藜蘆醇誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞細(xì)胞凋亡及其與p38 MAPK信號(hào)途徑的聯(lián)系

華叢書(shū)1，陳海1，張朝東1，趙歡2，陳曉宇2

摘要目的探討白藜蘆醇（Res）誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞株凋亡及其與p38 MARK信號(hào)通路的聯(lián)系。方法CCK-8法檢測(cè)Res對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖抑制作用，Annexin VFITC／PI雙染法檢測(cè)Res對(duì)肺癌A549細(xì)胞凋亡率，Western blot法檢測(cè)Res對(duì)人肺癌A549細(xì)胞Caspase剪切片斷（Caspase-1、Caspase-3）表達(dá)的影響，及其對(duì)絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）通路蛋白（p38、p-p38）表達(dá)的影響。結(jié)果Res對(duì)人肺癌A549細(xì)胞株生長(zhǎng)呈濃度依賴性的抑制作用，48 h的Res作用肺癌A549的半數(shù)抑制濃度（IC50）值為（10．6± 1．2）μmol／L。用 10μmol／L Res處理A549細(xì)胞 24、36、48 h，細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯增加（P＜0．01）。Res作用于A549細(xì)胞 48 h后，Western blot法檢測(cè)顯示 Caspase-1、Caspase-3蛋白出現(xiàn)斷裂片斷，p38、p-p38表達(dá)亦增高。結(jié)論Res明顯誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞毒作用，誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與激活p-p38 MAPK途徑有關(guān)。

關(guān)鍵詞細(xì)胞凋亡；信號(hào)通路；白藜蘆醇；肺癌A549細(xì)胞

天然的多酚類化合物白藜蘆醇（resveratrol，Res）廣泛存在于葡萄、虎杖、花生等植物體內(nèi)。近年來(lái)，Res的藥理作用得到充分研究，Res具有廣泛的生物學(xué)和藥理學(xué)活性，如抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和神經(jīng)保護(hù)等效應(yīng)［1］。研究［2］證實(shí)，絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-actived protein kinase，

2015－06－15接收

2安徽醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室，合肥230032

1　材料與方法

1．1材料

人肺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自上海中科院藥物研究所，傳代培養(yǎng)；Res（純度≥99．8%）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，溶解于DMSO；RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本DOJINDO公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自日本Sanyo公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；酶標(biāo)儀680型購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；Annexin V－FITC／PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海晶美生物公司；p38、磷酸化（p-p38）、ECL化學(xué)發(fā)光劑購(gòu)自美國(guó)Cell Signal公司；兔多克隆抗體 Caspase剪切片斷（Caspase-1、Caspase-3）、β-actin及抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；細(xì)胞裂解液購(gòu)自美國(guó)Upstate生物技術(shù)公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1．2方法

1．2．1細(xì)胞培養(yǎng)和傳代

人肺癌A549細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)液（含10%的胎牛血清）置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3 d更換RPMI 1640培養(yǎng)1次。當(dāng)A549細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，0．25%胰蛋白酶消化、傳代細(xì)胞。

1．2．2CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖

96孔板中，2 000個(gè)／孔的細(xì)胞密度接種A549細(xì)胞，分別加入Res（1、5、10、20、50μmol／L）組、空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組（等濃度DMSO），每組設(shè)4個(gè)平行孔。48 h后，采用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖，讀取450 nm波長(zhǎng)的吸光度（absorbance，A）值，即A450反映細(xì)胞增殖。細(xì)胞增殖率（%）＝各組A450／空白對(duì)照組A450× 100%。細(xì)胞增殖抑制率（%）＝（1－用藥組A450／空白對(duì)照組A450）×100%。按濃度梯度的對(duì)數(shù)將細(xì)胞增殖抑制率進(jìn)行曲線擬合，計(jì)算Res的半數(shù)抑制濃度（halfmaximal inhabitory concentration，IC50）。

1．2．2Annexin V-FITC／PI雙染細(xì)胞法檢測(cè)

在檢測(cè)Res的IC50后，用10μmol／L Res處理A549細(xì)胞24、36、48 h，收集不同時(shí)間點(diǎn)Res處理A549細(xì)胞，胰酶消化，PBS洗滌2次，每次10 min，3 000 r／min離心5 min；1×結(jié)合緩沖液調(diào)整細(xì)胞密度為1×106／m l。取單細(xì)胞懸液0．5 ml，加入Annexin V-FITC 1．25μl，室溫18～24℃、避光、靜置15 min后離心；吸棄上層液體，加1×結(jié)合緩沖液0．5 m l重懸細(xì)胞，加入PI（10 mg／L）10μl染色，將標(biāo)本置于冰塊中、避光。1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀上測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1．2．3Western blot法檢測(cè)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺癌A549細(xì)胞，RPMI1640稀釋至3×105個(gè)／ml，25 m l小培養(yǎng)瓶中接種培養(yǎng)，不同濃度Res（1、10、30μmol／L）的藥物作用48 h后，收集 A549細(xì)胞，PBS洗滌2次，每次10 min，加入100μl細(xì)胞裂解液，15 000 r／min離心10 min，BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白，將蛋白濃度調(diào)整一致。取裂解蛋白40 μg，加入3×SDS上樣緩沖液，95℃變性10 min。配制12%的SDS-PAGE分離膠，凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，5%脫脂牛奶封閉，依次加入相應(yīng)的一抗（兔多克隆抗體Caspase-1、Caspase-3、p38、pp38）4℃孵育過(guò)夜，以GAPDH作為內(nèi)參。次日，pH ＝7．4的 TBST緩沖液（10 mmol／L Tris-Hcl，150 mmol／L NaCl，0．1%Tween 20）洗滌3次，每次10 min，加入相應(yīng)二抗，37℃孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3次，在室溫下孵育2 h，洗滌3次，每次10 min，加入ECL檢測(cè)目的條帶的表達(dá)，放入暗盒中壓片，2 ～5 min后顯影、定影。

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1Res對(duì)肺癌A549細(xì)胞體外增殖活性的抑制作用

Res（1、5、10、20和50μmol／L）對(duì)A549腫瘤細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用（F＝8．641，P＝0．027），48 h，對(duì)A549細(xì)胞IC50時(shí)Res濃度值為（10．6±1．2）μmol／L，95%可信區(qū)間為56．2～63．6。與溶劑對(duì)照組比較，Res能明顯抑制A549細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)明顯的濃度－效應(yīng)關(guān)系。見(jiàn)圖1。

2．1．1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

本研究采用10μmol／L Res處理A549細(xì)胞，24、36、48 h，細(xì)胞凋亡率分別為（15．2±2．7）%、（22．8±3．6）%、（29．6 ±3．7）%，溶劑對(duì)照組細(xì)胞凋亡率僅為（2．3± 1．2）%，表明細(xì)胞凋亡率顯著增加（F＝13．476，P＝0．006）。見(jiàn)圖2。

2．1．2Res對(duì)肺癌A549細(xì)胞中Caspase-1、Caspase-3蛋白剪切的影響

完整的Caspase復(fù)合物（Caspase-1、Caspase-3）無(wú)活性，剪切后其被激活。用不同濃度 Res（1、10、30μmol／L）作用于肺癌A549細(xì)胞48 h后，Western blot法檢測(cè)顯示，隨著Res濃度的升高，Caspase-1、Caspase-3斷裂片段升高明顯。而未用Res處理的溶劑對(duì)照組無(wú)斷裂片段表達(dá)（圖3）。結(jié)果顯示，Caspase-1和Caspase-3已被快速活化，從而誘導(dǎo)肺癌 A549細(xì)胞凋亡。

2.2Res誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡的p38 MAPK通路的的影響

Western blot法檢測(cè)10μmol／L Res處理肺癌A549細(xì)胞24、36、48 h，結(jié)果表明，24 h后p-p38 MAPK顯著增加，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，p-p38 MAPK增加更為明顯，總的p38 MAPK的變化不明顯（圖4）。可見(jiàn)，p-p38是其活性形式，這表明Res激活了p38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

3　討論

Res含有多酚結(jié)構(gòu)，具有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化和抗自由基、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力作用［1］。研究［3］顯示，Res對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有干擾和保護(hù)作用，Res能夠防止細(xì)胞癌變、抑制腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散。本研究結(jié)果表明，與溶劑對(duì)照組比較，Res對(duì)肺癌A549細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，隨著Res劑量的升高，其抑制作用增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系。

本研究表明，Res對(duì)肺癌A549細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖抑制作用。為證實(shí)此作用是否與促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞凋亡有關(guān)，本研究應(yīng)用 Res（10μmol／L）處理A549細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)顯示，Res作用24、36、48 h，肺癌A549細(xì)胞凋亡率明顯高于溶劑對(duì)照組，具有一定的時(shí)間－效應(yīng)依賴關(guān)系。故Res有抑制肺癌A549細(xì)胞增殖的作用，促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞凋亡。

研究［4］表明，Res通過(guò)影響凋亡相關(guān)基因表達(dá)影響誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，Res可通過(guò)Fas-FasL途徑誘導(dǎo)人直腸癌細(xì)胞株發(fā)生凋亡現(xiàn)象。Caspase-1 和Caspase-3在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。Caspase-1位于細(xì)胞凋亡途徑的上游，其發(fā)生剪切后活化，活化的Caspase-1作為始動(dòng)Caspase復(fù)合物，進(jìn)一步誘導(dǎo)效應(yīng)Caspase-3的活化，導(dǎo)致Caspase-3也發(fā)生斷裂，降解重要底物，使得蛋白酶級(jí)聯(lián)切割放大，使細(xì)胞最終走向凋亡［5］。本研究中，肺癌A549細(xì)胞中的Caspase-1和Caspase-3蛋白在加入Res處理后均發(fā)生斷裂，且呈濃度依賴關(guān)系。故Res能誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡，其機(jī)制與Caspase復(fù)合物的活化和級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)相關(guān)。

為探討Res誘發(fā)肺癌A549細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，本研究檢測(cè)了p38 MAPK信號(hào)通路有關(guān)蛋白的表達(dá)。p38 MAPK含有絲氨酸／蘇氨酸殘基的蛋白激酶，廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中，p38 MAPK激活后可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡等活動(dòng)［6－7］。p38定位于靜止細(xì)胞的胞質(zhì)中，激活后，p38移位至細(xì)胞核，激活一系列轉(zhuǎn)錄因子，引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)。如p38磷酸化激活轉(zhuǎn)錄因子，參與轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP-1的構(gòu)成，進(jìn)一步調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α、p53、原癌基因等基因的表達(dá)，引起細(xì)胞凋亡［8］。本研究顯示Res明顯激活p38途徑，調(diào)控肺癌A549細(xì)胞凋亡，但其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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中圖分類號(hào)R 737．3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000－1492（2015）10－1447－04

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：81373421）

作者單位：1安徽省胸科醫(yī)院胸外科，合肥230022

作者簡(jiǎn)介：華叢書(shū)，男，碩士；陳曉宇，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：chenxy＠ahmu．edu．cnMAPKs）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是多種細(xì)胞的生存、凋亡信號(hào)傳導(dǎo)，p38通路通常介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。有關(guān)Res對(duì)肺癌的作用報(bào)道較少，該研究擬探討Res對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖的影響，Res能否誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡，及其與激活p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間的關(guān)系。

Apoptosis induced by resveratrol in human lung cancer A549 cells and relation with p38 MAPK signal pathway

Hua Congshu，Chen Hai，Zhang Chaodong，etal
（Dept of Thoracic Surgery，Anhui Province Chest Hospital，Hefei230022）

AbstractObjectiveTo study resveratrol（Res）-induced apoptosis in human lung cancer A549 cells and relation with mitogen-actived protein kinase（MAPK）signal pathway．MethodsCytotoxicity was analyzed by CCK-8method．Apoptotic cells were stained with Annexin V－FITC／PIand were detected by flow cytometry．Protein expressions of cleavage of the Caspases（Caspase-1，Caspase-3）and MAPK（p38，p-p38）were detected by Western blot analysis．ResultsRes inhibited proliferation of A549 cellswith IC50value of（10．6±1．2）μmol／L and induced cell apoptosis．Compared with the control group，apoptotic ratio increased rapidly within 24，36，48 h after Res （10μmol／L）treatment．Cleavage of the Caspase-1，Caspase-3 was observed in A549 cells treated with different doses of Res for 48 h．p38，p-p38 were activated．ConclusionRes inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells．Activation of p38 pathwaysmay be one of itsmechanisms．

Key wordsapoptosis；signal pathway；resveratrol；lung cancer A549 cells