蠶蛹蟲草中蟲草素和腺苷含量影響因素研究

施新琴　顧寅鈺　郭光等

摘要： 以雙蒸水為溶劑，用反相高效液相色譜-紫外檢測法測定蠶蛹蟲草樣品中蟲草素和腺苷含量，并用該方法測定了19-3、17-3、MS、1-1以及1-Y等12種不同蟲草菌株栽培的蠶蛹蟲草、不同品質(zhì)的蠶蛹蟲草以及蠶蛹蟲草不同組織中的蟲草素和腺苷的含量。結(jié)果表明：1-Y菌株的蟲草素和腺苷含量均最高，質(zhì)量分數(shù)達15.45 mg/g和4.40 mg/g；不同品質(zhì)的蠶蛹蟲草中蟲草素則以感染而未出草的僵蠶最高；蠶蛹蟲草的僵蠶體對蟲草素的富集能力高于子座，蠶蛹蟲草的子座對腺苷的富集能力高于僵蠶體。該結(jié)果可對探求高蟲草素含量和高腺苷含量的蟲草材料提供理論依據(jù)。

關鍵詞：蟲草素；腺苷；含量；影響因素；高效液相色譜

中圖分類號：S886.9 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2015）01-0109-03

Abstract The contents of cordycepin and adenosine in Cordyceps militaris samples of different qualities， different parts and inoculated with 12 different strains such as 19-3， 17-3， MS， 1-1 and 1-Y were determined by RP-HPLC using double distilled water as solvent. The results indicated that the contents of cordycepin and adenosine in 1-Y were both the highest， and the mass fraction reached 15.45 mg/g and 4.40 mg/g respectively. In Cordyceps militaris of different qualities， the content of cordycepin in silkworm infected but no fruiting were the highest. The enrichment ability of silkworm body to cordycepin was higher than stroma， while that of stroma to adenosine was higher than silkworm body. These results provided theoretical basis for seeking Cordyceps militaris with high cordycepin and adenosine contents.

Key words Cordycepin； Adenosine； Content； Influence factors； RP-HPLC

蠶蛹蟲草（Cordyceps militaris），即以家蠶幼蟲為寄主栽培的蛹蟲草，其蟲草形態(tài)更接近天然蟲草[1]，其所特有蟲草素具有抗腫瘤、抗病毒等方面的作用而引起醫(yī)學界的高度重視。腺苷在抗病毒，抗菌，預防治療腦血栓、腦溢血，抑制血小板積聚，防止血栓形成，消除面斑和抗衰防皺等方面效果較佳[2]。

由于蟲草中蟲草素和腺苷含量均偏低，因此快速、準確檢測蟲草中蟲草素和腺苷含量，對蠶蛹蟲草品質(zhì)鑒定至關重要，而提供高蟲草素和腺苷含量的蠶蛹蟲草材料對于蠶蛹蟲草的提純、深加工等開發(fā)、利用具有舉足輕重的作用，但是相關報道較少。為此，筆者建立了反相高效液相色譜法，利用19-3、17-3、MS、1-1以及1-Y等12種不同蛹蟲草菌株栽培蠶蛹蟲草，快速測定蟲草素和腺苷含量，以探求高蟲草素和腺苷含量的蟲草材料。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑和儀器

菌株：1-Y、DL-4 、MS、DL-5、DL-2、DL-6、19-3、DL-1，用于測定不同菌株對蠶蛹蟲草中蟲草素和腺苷含量的影響； JL-3、 JL-9，用于測定同一菌株接種后出草的蟲草和不出草蠶體蟲草素及腺苷含量比較；MS、19-3、1-Y、17-3和1-1，用于測定蟲草不同部位中蟲草素和腺苷的含量。

材料：本研究室培育的蠶蛹蟲草樣品，栽培方法見文獻[3～5]，經(jīng)80℃烘干，粉碎，過80目篩后，-20℃冷凍保存待測。

試劑：蟲草素標樣（SIGMA），腺苷（常州大康）；四氫呋喃（色譜純），甲醇（色譜純）；KH2PO4、K2HPO4、乙醇均為分析純，試驗用水為自制雙蒸水。

儀器：高效液相色譜儀（大連依利特）配UV200紫外-可變波長檢測器，WATERS NOVPAK- C18色譜柱 （5 μm×40 cm）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)）；格蘭仕微波爐；0.2 μm濾膜，25 μL微量進樣器。

1.2 方法

1.2.1 蟲草素和腺苷的提取[6]準確稱取蟲草樣品0.1 g，加入雙蒸水1 mL，渦流1 min，微波中高火提取1 min，靜置得蟲草素、腺苷提取液，過0.2 μm濾膜得待測液。

1.2.2 測定方法 采用RP-HPLC法[7]，檢測波長259 nm，流動相為四氫呋喃-0.1%甲醇-磷酸鹽緩沖液（1∶2∶97，V/V），流速為1.0 mL/min，進樣量20 μL，重復3次。分析軟件為Echrom98工作站，外標法分析計算。測試完畢用流動相洗色譜柱30 min除去雜質(zhì)，再用3%甲醇平衡30 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶蛹蟲草的色譜圖分析

以上述RP-HPLC方法測定樣品中蟲草素和腺苷的含量，色譜圖（圖1、圖2）顯示目標色譜峰分離效果好。精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和加樣回收率等試驗結(jié)果均表明該方法穩(wěn)定可靠，是測定蠶蛹蟲草樣品中蟲草素和腺苷含量的有效方法。endprint

2.2 不同菌株對蠶蛹蟲草中蟲草素和腺苷含量的影響

以1-Y、MS、19-3、DL-1、DL-2、DL-4、DL-5和DL-6共計8種菌株侵染蠶體培育蠶蛹蟲草，研究不同菌株對蠶蛹蟲草中蟲草素和腺苷含量影響。結(jié)果（表1）表明：菌株直接影響蠶蛹蟲草中蟲草素和腺苷的含量，其中1-Y菌株的蟲草素和腺苷含量均最高，質(zhì)量分數(shù)達15.45 mg/g和4.40 mg/g。DL-1的蟲草素含量最低，質(zhì)量分數(shù)為6.56 mg/g，DL-6的腺苷含量最低，質(zhì)量分數(shù)為0.84 mg/g。

2.3 不同出草情況對蠶蛹蟲草中蟲草素和腺苷含量的影響

同一菌株接種感染后，有的蠶體經(jīng)歷僵化、菌絲旺盛生長、轉(zhuǎn)色過程，但最終未能長出子座，簡稱為未出草僵蠶體。相反，蠶體經(jīng)歷僵化、菌絲旺盛生長、轉(zhuǎn)色過程，最終長出若干子座的，簡稱蠶蛹蟲草全株。由表2看出，JL-3和JL-9兩種菌株接種后未出草蠶體中蟲草素含量遠高于出草的蠶蛹蟲草，是正常出草蠶體的2倍還多；但腺苷的表現(xiàn)規(guī)律性不強，JL-3菌株出草的蟲草全株中含量高于未出草的蠶體，而JL-9菌株出草的蟲草全株中含量低于未出草的蠶體。

2.4 不同部位對蠶蛹蟲草中蟲草素和腺苷含量的影響

為了探討不同部位對蠶蛹蟲草中蟲草素和腺苷含量的影響，測定了19-3、17-3、MS、1-1以及1-Y感染的蠶蛹蟲草。圖3表明蟲草素含量在未出草僵蠶體內(nèi)極高，尤其是MS菌株感染的蟲草素含量達15.30 mg/g；出草的蠶蛹蟲草中僵蠶體中蟲草素含量高于子座中的，其中1-Y菌株感染的僵蠶含量最高，達9.44 mg/g，最低的是17-3菌株感染蠶蛹蟲草的子座，僅為0.74 mg/g。圖4表明，蠶蛹蟲草子座中腺苷含量普遍高于僵蠶體中的，其中1-Y菌株感染的蠶蛹蟲草子座中含量最高，達3.15 mg/g。比較可以看出MS 和1-Y菌株的性狀較佳。

3 討論

用RP-HPLC方法測定樣品中蟲草素和腺苷的含量，目標色譜峰分離效果好，結(jié)果穩(wěn)定可靠，是測定各種蟲草樣品中蟲草素和腺苷含量的有效方法。高蟲草素含量的材料是蠶蛹蟲草的僵蠶體，而高腺苷含量的蟲草材料是蠶蛹蟲草的子座。

蠶蛹蟲草中的蟲草素和腺苷含量受多種因素的影響，如菌株、溫度、濕度和光照等。本研究結(jié)果顯示蠶蛹蟲草中的蟲草素和腺苷含量均隨侵染菌株、蟲草品質(zhì)以及蟲草組織部位的不同而變化。其中出草的蠶蛹蟲草中1-Y菌株感染的蟲草素和腺苷含量最高，不同品質(zhì)的蠶蛹蟲草中蟲草素則以感染而未出草的僵蠶最高，蟲草素的富集部位則為僵蠶體，與孫迎節(jié)等[9]結(jié)論相同，但申鴻等[10]、溫魯?shù)萚8]認為蟲草素的富集部位為子座。原因有兩方面，一方面是由于菌株不同，表現(xiàn)不同而影響了結(jié)論；另一方面是出草管理如光照、濕度等對蟲草素的積累可能也有一定的影響。應進一步研究明確蟲草素的形成時期及其它影響蟲草素形成的因素。

參 考 文 獻：

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[3]顧寅鈺，李化秀，施新琴，等.蠶蟲草人工栽培技術(shù)研究[J].中國蠶業(yè)，2012，33（2）：35-38.

[4]顧寅鈺，張亞平，陳傳杰，等.蛹蟲草培養(yǎng)基碳源和氮源對菌絲生長量的影響[J].山東農(nóng)業(yè)科學，2008（7）：77-79.

[5]張亞平，顧寅鈺，施新琴，等.人工飼料育家蠶幼蟲培育北蟲草的試驗[J].山東蠶業(yè)，2009（2）：33-34.

[6]夏敏.反相高效液相色譜法測定蛹蟲草中蟲草素的含量[J].淮陰工學院學報，2004，13（3）：22-24.

[7]施新琴，顧寅鈺，張亞平，等.高效液相色譜法測定蟲草中蟲草素和腺苷含量的研究[J].山東蠶業(yè)， 2009（2）：8-10.

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[9]孫迎節(jié)，呂鵬，凌建亞，等.九州蟲草的核苷類成分及不同部位兩種活性成分含量的分布[J].藥學學報，2003，38（9）：690-694.

[10]申鴻，張龍，王兵，等.蠶體和蛹粉代料培養(yǎng)基上的蛹蟲草生長狀況與品質(zhì)檢測[J].蠶業(yè)科學，2012，38（1）：130-134.endprint