大黃素對人宮頸癌裸鼠移植瘤Bcl-2蛋白及其相關X蛋白表達的影響

陶永梅,徐丹,王子一,侯立強,王智

(黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院藥劑科,哈爾濱 150001)

·基礎研究·

大黃素對人宮頸癌裸鼠移植瘤Bcl-2蛋白及其相關X蛋白表達的影響

陶永梅,徐丹,王子一,侯立強,王智

(黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院藥劑科,哈爾濱 150001)

目的 觀察大黃素對人宮頸癌siha、Hela和C33A細胞株裸鼠移植瘤Bcl-2和Bcl-2相關X蛋白(Bax)表達的影響，探討其對宮頸癌的作用機制。方法 建立人宮頸癌siha、Hela和C33A裸鼠移植瘤模型，隨機分為對照組、大黃素低劑量組和大黃素高劑量組，分別經灌胃給予0.1%二甲基亞砜(DMSO)0.2 mL/只、大黃素20 mg/kg和大黃素40 mg/kg，1 次/d,共14 d。給藥結束后處死裸鼠并取瘤組織,采用免疫組織化學法檢測Bcl-2和Bax蛋白表達。結果 與相應對照組相比較，隨著大黃素劑量增加Bcl-2蛋白表達明顯下降，Bax蛋白表達逐漸增高。其中大黃素對siha、Hela兩種細胞移植瘤Bcl-2和Bax蛋白表達的調控作用優于C33A細胞移植瘤。結論 大黃素可能通過下調Bcl-2蛋白表達，上調Bax蛋白表達，誘導腫瘤細胞凋亡，從而起到抑制人宮頸癌裸鼠移植瘤生長的作用。

宮頸腫瘤;大黃素；bcl-X蛋白質;bcl-2相關X蛋白質;小鼠;近交BALB C

宮頸癌是最常見的婦女惡性腫瘤，近年來其發病率居高不下，發病有年輕化趨勢。臨床研究證明宮頸癌的發生與高危型的人乳頭瘤病毒(HPV)感染關系密切，是引發宮頸癌的重要原因之一[1]。在宮頸癌組織中，尤其是高危型HPV16/18 等亞型在宮頸癌組織中檢出率達50%～90% ,其感染與宮頸癌的臨床進程及預后有關，機體的細胞凋亡調控機制失衡可能參與了宮頸癌的發生和發展進程[2-4]。我們前期研究表明大黃素能明顯地抑制人宮頸癌裸鼠移植瘤生長，并呈現出一定的劑量依賴性，而且對siha、Hela兩種細胞移植瘤抑制效果優于C33A細胞移植瘤。本研究觀察了大黃素對人宮頸癌siha、Hela和C33A細胞株裸鼠移植瘤Bcl-2和Bcl-2相關X蛋白(Bax)表達的影響，進一步探討其對宮頸癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 大黃素(美國Sigma 公司)；胎牛血清(四季青公司)；青-鏈雙抗、胰酶和二甲基亞砜(DMSO,碧云天)；RPMI-1640和DMEM低糖培養基(Hyclone公司)；人宮頸癌Siha、HeLa和C33A細胞株(中國科學院上海細胞研究所)；兔抗Bcl-2和Bax多克隆抗體(武漢博士德)；二步法二抗PV6001和DAB顯色劑(北京中杉)；其他為國產分分析純。

1.2 實驗動物 清潔級BALB/c/nu雌性小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK京2012-0001)，4～6周齡，體質量為18～20 g，飼養條件：SPF級屏障系統的潔凈層流架內，室溫控制在25 ℃，相對濕度控制為40%～60%。

1.3 細胞培養 三種細胞株培養條件如下：Siha細胞株：RPMI-1640培養基+10%胎牛血清+1%雙抗；Hela細胞株：RPMI-1640培養基+10%胎牛血清+1%雙抗；C33A細胞株：DMEM培養基+10%胎牛血清+1%雙抗。培養條件：37 ℃、5%的CO2、飽和濕度。使細胞單層貼壁生長，等到70%～80%融合時胰酶消化傳代。

1.4 裸鼠皮下移植瘤的建立及給藥方案 收集對數生長期的三種細胞Siha、HeLa和C33A,經離心懸浮沉淀后顯微鏡下計數,并調整細胞懸液濃度和計算活細胞數；在超凈工作臺內無菌條件下將三種細胞株分別接種于裸鼠右大腿根部皮下，建立A(siha細胞)、B(Hela細胞)和C(C33A細胞)三種細胞移植瘤的模型。

至第15天左右將已移植成功的各模型裸鼠隨機分成對照組、低劑量組及高劑量組，每組為6只。大黃素：0.1%的DMSO為溶劑，分別配制成0.2% 和0.4%的濃度，待用于裸鼠灌胃給藥。三組裸鼠實驗組分別經灌胃給予0.1%二甲基亞砜(DMSO)0.2 mL/只、大黃素20 mg/kg以及大黃素40 mg/kg，每日給藥1次,如此連續14 d。

1.5 免疫組織化學檢測 給藥結束后處死裸鼠,剝離腫瘤組織置于4%多聚甲醛中固定，常規脫水后石蠟包埋，切片進行免疫組織化學檢測，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

Motic3000顯微攝影系統于400倍下攝片，采用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統對陽性表達進行定量分析，以積分吸光度(IOD) 代表蛋白相對表達量，積分吸光度(IOD)=陽性面積×平均吸光度，每組隨機分析6個高倍鏡視野。染色結果細胞核呈藍色，陽性表達為黃色或黃棕色。

1.6 統計學處理 應用SPSS 18.0統計軟件進行方差分析,組間比較t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大黃素對人宮頸癌Siha細胞裸鼠移植瘤Bcl-2和Bax蛋白表達的影響 與對照組相比，大黃素低劑量和高劑量組Bcl-2蛋白表達有不同程度的降低，Bax蛋白表達有不同程度的增高，見表1。

表1 各組人宮頸癌Siha細胞裸鼠移植瘤Bcl-2和Bax蛋白表達

注：與對照組比較,aP<0.01

2.2 大黃素對人宮頸癌HeLa細胞裸鼠移植瘤Bcl-2和Bax蛋白表達的影響 與對照組相比，大黃素低劑量和高劑量組Bcl-2蛋白表達有不同程度的降低，Bax蛋白表達有不同程度的增高，見表2。

表2 各組人宮頸癌HeLa細胞裸鼠移植瘤Bcl-2和Bax蛋白表達

注：與對照組比較,aP<0.01

2.3 大黃素對人宮頸癌C33A細胞裸鼠移植瘤Bcl-2和Bax蛋白表達的影響 與對照組相比，大黃素低劑量和高劑量組Bcl-2蛋白表達有不同程度的降低，Bax蛋白表達有不同程度的增高，見表3。

表3 各組人宮頸癌C33A細胞裸鼠移植瘤Bcl-2和Bax蛋白表達

注：與對照組比較,aP<0.01,bP<0.05

3 討論

腫瘤的發病與細胞凋亡失衡關系密切[5],研究顯示Bcl-2/Bax 在宮頸癌組織中存在異常表達[2-4]。細胞凋亡是機體中細胞在生長發育過程中發生的一種程序性死亡，涉及復雜的生理和病理過程,對機體起著極其重要的調控作用。Bcl-2 家族基因是細胞凋亡的重要調控因素之一,其中Bcl-2可以抑制細胞凋亡,Bax 是Bcl-2 的同源基因,可拮抗Bcl-2使細胞趨于凋亡[6-7]。

大黃素是一種蒽醌類化合物，是中藥大黃等的主要有效成分，研究表明其具有很好的抗腫瘤作用，體外可抑制胰腺癌、卵巢癌、肺癌和白血病等多種惡性腫瘤細胞生長[8]。我們前期研究結果表明：大黃素能顯著抑制siha、Hela和C33A三種人宮頸癌細胞裸鼠移植瘤的瘤重、生長體積，對siha和Hela細胞移植瘤作用更為明顯，且呈一定的劑量依賴性。本研究結果表明:與相應對照組相比較，隨著大黃素劑量增加Bcl-2蛋白表達明顯下降，Bax蛋白表達逐漸增高。其中大黃素對siha、Hela兩種細胞移植瘤Bcl-2和Bax蛋白表達的調控作用優于C33A細胞移植瘤。因此我們推測，大黃素可能通過下調Bcl-2蛋白表達，上調Bax蛋白表達，誘導腫瘤細胞凋亡，從而起到抑制人宮頸癌裸鼠移植瘤生長的作用。

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黑龍江省教育廳科學技術研究(面上)項目(12541757)

陶永梅，副主任藥師，Email:taoyongmei72@163.com

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10.3969/J.issn.1672-6790.2015.02.024

2015-01-12)