HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定“武當(dāng)二號(hào)”忍冬葉中綠原酸和木犀草苷的含量*

李鵬，鄭芳，李聰，李志浩，黃麟杰，朱雪松

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院藥學(xué)部、武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，十堰 442008)

HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定“武當(dāng)二號(hào)”忍冬葉中綠原酸和木犀草苷的含量*

李鵬，鄭芳，李聰，李志浩，黃麟杰，朱雪松

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院藥學(xué)部、武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，十堰 442008)

目的 建立同時(shí)測(cè)定“武當(dāng)二號(hào)”忍冬葉中綠原酸和木犀草苷含量高效液相色譜測(cè)定方法。方法 采用Phenomenex C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.4%磷酸溶液(B)進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm；流速0.8 mL·min-1；柱溫32 ℃。結(jié)果 綠原酸、木犀草苷分別在進(jìn)樣量0.285～2.280，0.124～1.240 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 3，0.999 4；平均加樣回收率分別為98.9%，98.8%(n=6)，RSD分別為1.59%，1.84%。結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好，可以用來(lái)同時(shí)測(cè)定“武當(dāng)二號(hào)”忍冬葉中綠原酸和木犀草苷的含量。

“武當(dāng)二號(hào)”忍冬葉；綠原酸；木犀草苷；檢測(cè)器，高效液相色譜法-二極管陣列

“武當(dāng)二號(hào)”忍冬為樹(shù)形忍冬即木本忍冬，為湖北武當(dāng)生物醫(yī)藥科技有限公司將山東“亞特良種忍冬(LonicerajaponicaYatehong LSB)”(經(jīng)國(guó)家林業(yè)局審定)與武當(dāng)?shù)貐^(qū)忍冬相結(jié)合進(jìn)行培育，培植出適合十堰地區(qū)生長(zhǎng)的優(yōu)良獨(dú)特品種。該品種不同于普通的藤本忍冬品種(把傳統(tǒng)藤本培育成小灌木)，生長(zhǎng)快，一年可采四季，采收省工，且產(chǎn)量是傳統(tǒng)品種的數(shù)倍，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值。金銀花是我國(guó)常用中藥材，具有疏散風(fēng)熱、清熱解毒的功效[1]。忍冬的葉即忍冬葉與金銀花均有清熱解毒之功效[2]，每年隨著忍冬植株整形修剪可以得到大量的枝葉，其產(chǎn)量是花的數(shù)倍，但作為金銀花副產(chǎn)物，忍冬葉一直被視為非藥用部位而未得到充分利用，造成了極大的資源浪費(fèi)[3]。忍冬葉主要化學(xué)成分為綠原酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)等，目前研究的重點(diǎn)是綠原酸類(lèi)和黃酮類(lèi)，也是發(fā)揮藥效作用物質(zhì)基礎(chǔ)[4]。《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部已將綠原酸(有機(jī)酸類(lèi))和木犀草苷(黃酮苷類(lèi))作為金銀花的質(zhì)量控制指標(biāo)，但“武當(dāng)二號(hào)”忍冬葉中有關(guān)綠原酸、木犀草苷的含量測(cè)定方法筆者未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[5-12]，采用反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定“武當(dāng)二號(hào)”忍冬葉中綠原酸和木犀草苷的含量，操作簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，為建立“武當(dāng)二號(hào)”金銀花葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UltiMate 3000 高效液相色譜儀(DIONEX)，UltiMate3000 Photodioce Array Detector(DIONEX)，UltiMate 3000 Pump(DIONEX)，Chromeleon色譜工作站(DIONEX)；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器(功率100 W，頻率40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司)；FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)[CZX-OH-40X4-5型，額定頻率(50±1) Hz，天津市泰斯特儀器有限公司]；電熱恒溫干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；AEU-210萬(wàn)分之一電子分析天平(日本島津公司)。

1.2 試藥 綠原酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-200212)；木犀草苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111720-200604)；武當(dāng)二號(hào)忍冬葉2013年5月采自湖北武當(dāng)生物醫(yī)藥科技有限公司種植園，經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院武當(dāng)研究所陳吉炎教授鑒定為忍冬科植物紅白忍冬[LonicerajaponicaThunb.var.chinensis(Wats.) Bak.] 的干燥葉；乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純)；冰醋酸為科密歐色譜純?cè)噭?天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心)；甲醇(分析純，批號(hào)：20110913)、無(wú)水乙醇(分析純，批號(hào)：20110515)，均購(gòu)于武漢市中天化工有限責(zé)任公司；水為經(jīng)檢驗(yàn)合格的自制注射用水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 色譜柱：Phenomenex ODS色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：以乙腈(A)-0.4%磷酸溶液(B)，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?～6 min，A：B=13：87；～7 min，A13%→20%，B87%→80%；～17 min，A：B=20：80；～18 min，A20%→13%，B80%→87%；～25 min，A：B=13：87；檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm；流速0.8 mL·min-1；柱溫32 ℃；進(jìn)樣量10 μL。依照上述色譜條件，分別進(jìn)樣綠原酸、木犀草苷對(duì)照品溶液、“武當(dāng)二號(hào)”忍冬葉樣品溶液，記錄色譜圖(圖1)。結(jié)果綠原酸、木犀草苷保留時(shí)間分別約為5.7，13.3 min，理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)不低于7 000，按木犀草苷峰計(jì)不低于40 000，且各色譜圖中綠原酸和木犀草苷峰的DAD匹配值均不低于999.8，說(shuō)明綠原酸和木犀草苷峰基本為純峰[12]。

2.2 對(duì)照品溶液制備 稱取綠原酸對(duì)照品57.0 mg，加50%甲醇溶解稀釋?zhuān)渲瞥?.57 mg·mL-1對(duì)照品儲(chǔ)備液，取適量用50%甲醇稀釋10倍，得57 μg·mL-1對(duì)照品溶液；精密稱取木犀草苷對(duì)照品6.2 mg，加70%乙醇溶解稀釋?zhuān)渲瞥?2 μg·mL-1對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取在40 ℃下，于電熱恒溫干燥箱中干燥的“武當(dāng)二號(hào)”忍冬葉(過(guò)孔徑0.25 mm 篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，精密稱定，回流2 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用孔徑0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液適量為供試品溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別進(jìn)樣“2.2”項(xiàng)下的綠原酸對(duì)照品溶液0.285，0.570，0.855，1.140，1.710，2.280 μg和木犀草苷對(duì)照品溶液0.124，0.248，0.372，0.620，0.930，1.240 μg，記錄各自峰面積。以各自進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得綠原酸和木犀草苷的回歸方程分別為：Y綠=52.16X綠+1.509(r=0.999 3，n=6)，Y木=52.916X木+0.149 1(r=0.999 4，n=6)，結(jié)果表明，綠原酸和木犀草苷進(jìn)樣量分別在0.285～2.280，0.124～1.240 μg范圍內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)濃度為57 μg·mL-1綠原酸對(duì)照品溶液和濃度為62 μg·mL-1的木犀草苷對(duì)照品溶液各10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果綠原酸和木犀草苷峰面積的RSD分別為0.56%(n=6)，0.69%(n=6)。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)(批號(hào)：20130502)的“武當(dāng)二號(hào)”忍冬葉，按“2.3”項(xiàng)方法平行操作，制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣，記錄峰面積并計(jì)算綠原酸和木犀草苷含量，結(jié)果RSD分別為1.58%(n=6)，1.87%(n=6)。結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

A.混合對(duì)照品；B.綠原酸對(duì)照品； C.木犀草苷對(duì)照品；D.“武當(dāng)二號(hào)”忍冬葉樣品；1.綠原酸；2.木犀草苷

A.mixed reference；B.chlorogenic acid control；C.galuteolin control reference；D.“WudangNO.Ⅱ” honeysuckle leaves sample；1.chlorogenic acid；2.galuteolin

Fig.1 HPLC chromatogram of four kinds of solutions

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取批號(hào)為20130502 “武當(dāng)二號(hào)”忍冬葉(含綠原酸和木犀草苷分別為1.86%，0.23%)的供試品溶液10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別于0，4，8，12，16，24 h進(jìn)樣，記錄峰面積，得綠原酸和木犀草苷峰面積的RSD分別為0.99%，0.91%，說(shuō)表明在24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取“2.7”項(xiàng)已測(cè)含量的“武當(dāng)二號(hào)”忍冬葉(批號(hào)：20130502)各18份，每份約0.5 g，均分二組。一組分別精密加入濃度為0.93 g·L-1綠原酸對(duì)照品溶液8.0，10.0，12.0 mL(各3份)，另一組分別精密加入濃度為0.58 g·L-1木犀草苷對(duì)照品溶液1.8，2.0，2.4 mL(各3份)，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，將上述供試品溶液各進(jìn)樣5 μL(每份進(jìn)樣3次)，計(jì)算平均含量和回收率。結(jié)果綠原酸和木犀草苷的平均回收率分別為98.9%，98.8%；RSD分別為1.59%，1.84%，見(jiàn)表1。

2.9 樣品含量測(cè)定 按“2.3”項(xiàng)方法，測(cè)定3批“武當(dāng)二號(hào)”忍冬葉中的綠原酸和木犀草苷的含量，并與同一批在同樣干燥條件下(40 ℃中電熱恒溫干燥箱中干燥)的“武當(dāng)二號(hào)”金銀花在不同花期(花蕾期、銀花期、金花期)中的綠原酸和木犀草苷的含量做了對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 綠原酸和木犀草苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Recovery results of chlorogenic acid and galuteolin

組分取樣量/g原有量加入量測(cè)得量mg回收率/%綠原酸0.50069.3117.44016.63998.50.50139.3247.44016.890101.70.50439.3807.44016.64197.60.50369.3679.30018.55598.80.51059.4959.30018.53597.20.50429.3789.30018.64199.60.51029.49011.16020.41697.90.50209.33711.16020.27498.00.51119.50611.16020.789101.1木犀草苷0.51071.1751.0442.19998.10.50521.1621.0442.221101.40.52041.1971.0442.21597.50.51511.1851.1602.32498.20.51001.1731.1602.29897.00.50831.1691.1602.32899.90.51231.1781.3922.53997.80.50201.1551.3922.51197.40.51111.1761.3922.594101.9

3 討論

《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部規(guī)定用苯基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Agilent ZORBAX SB-pheny (250 mm×4.6 mm，5 μm)的色譜柱測(cè)定木犀草苷的含量，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱測(cè)定綠原酸的含量，本實(shí)驗(yàn)選用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱同時(shí)測(cè)二成分的含量。曾實(shí)驗(yàn)過(guò)大連依利特 Hypersil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Shodex Rspak DE C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent HC C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，最后根據(jù)色譜峰的柱效、分離效果、DAD匹配值及重復(fù)性等因素綜合考慮，選擇使用Phenomenex C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱。

表2 樣品中綠原酸和木犀草苷的含量測(cè)定結(jié)果

Tab.2 Content determination of chlorogenic acid and galuteolin in samples %，n=3

本實(shí)驗(yàn)確定流動(dòng)相B組分時(shí)，比較0.2%，0.4%磷酸溶液和0.2%，0.5%冰醋酸溶液，結(jié)果選擇0.4%磷酸溶液時(shí)，綠原酸峰和木犀草苷峰的理論板數(shù)最高，且均超過(guò)《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部規(guī)定(理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)不低于1 000、按木犀草苷峰計(jì)不低于20 000)的數(shù)倍；選擇流動(dòng)相時(shí)曾使用等度洗脫，由于“武當(dāng)二號(hào)”忍冬葉的化學(xué)成分復(fù)雜，雖然其綠原酸達(dá)到基線分離，但木犀草苷峰受相鄰峰的干擾很大，其峰的DAD匹配值很難達(dá)到999.0，故最終選用本文梯度洗脫程序。

本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[12]，以50%甲醇為提取溶劑、液料比為100 mL·g-1條件下，分別比較了超聲30，40，50，60，70，80，90 min(超聲功率100 W，頻率40 kHz)和回流60，80，100，120 min的提取率。結(jié)果超聲提取時(shí)，超聲80 min綠原酸和木犀草苷含量最高；回流提取時(shí)，回流120 min綠原酸和木犀草苷含量最高；但回流120 min綠原酸和木犀草苷含量比超聲80 min均高，故本實(shí)驗(yàn)采用回流120 min提取“武當(dāng)二號(hào)”忍冬葉中綠原酸和木犀草苷。

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DOI 10.3870/yydb.2015.05.025

Simultaneous Determination of Chlorogenic Acid and Luteoloside in the Leaves of“WudangNo.Ⅱ”Flos Lonicerae by HPLC-DAD

LI Peng, ZHENG Fang, LI Cong, LI Zhihao, Huang Linjie, ZHU Xuesong

(DepartmentofPharmacy,AffiliatedDongfengHospital,HubeiMedicalUniversity,HubeiKeyLaboratoryofWudangLocalChineseMedicineResearch,Shiyan442008,China)

Objective To establish a HPLC method for simultaneous determination of chlorogenic acid and luteoloside in the leaves of “WudangNo.Ⅱ” flos lonicerae. Methods Phenomenex C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm) was used; the mobile phase was acetonitrile(A)and 0.4% phosphoric acid aqueous solution(B)by gradient elution mode; the detection wavelength was 350 nm and the flow rate was 0.8 mL·min-1; the column temperature was set at 32 ℃. Results The calibration curve of chlorogenic acid and luteoloside to the peak area was linear in the range of 0.285-2.280 μg(r=0.999 3), and 0.124-1.240 μg(r=0.999 4), respectively.The mean recovery of chlorogenic acid and luteoloside was 98.9%, RSD=1.59% and 98.8%, RSD=1.84%, respectively. Conclusion This method is found to be accurate, quick and reproducible.It can be used for simultaneous determination of chlorogenic acid and luteoloside in the leaves of “WudangNO.Ⅱ”flos lonicerae.

Leaves of“WudangNo.Ⅱ” flos lonicerae；Chlorogenic acid；Luteoloside; Detector, high performance liquid chromatography-diode array

2013-12-16

2014-07-03

*湖北省2011協(xié)同創(chuàng)新中心基金(4)

李鵬(1968-)，男，湖北十堰人，副教授，主任藥師，在讀博士，主要從事醫(yī)院藥學(xué)工作。電話：0719-8272346，E-mail：dfyylp@163.com。

朱雪松(1974-)，男，湖北十堰人，副教授，主任藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)工作。電話：0719-8272346，E-mail：dfpharmacy@163.com。

R282.71；R927.2

B

1004-0781(2015)05-0660-04