貴州產(chǎn)金耳環(huán)不同采收期多糖的含量變化及止血作用*

魏學(xué)軍，夏亞蘭，林先燕，李雪營(yíng)，余躍生

(黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥學(xué)系，都勻 558003)

貴州產(chǎn)金耳環(huán)不同采收期多糖的含量變化及止血作用*

魏學(xué)軍，夏亞蘭，林先燕，李雪營(yíng)，余躍生

(黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥學(xué)系，都勻 558003)

目的 觀察貴州產(chǎn)金耳環(huán)不同采收期多糖含量的變化及止血作用。方法 利用水提醇沉法提取金耳環(huán)多糖，經(jīng)除雜、純化后，采用紫外分光光度法測(cè)定多糖含量；采用剪尾法及玻片法測(cè)定小鼠出、凝血時(shí)間。結(jié)果 不同采收期金耳環(huán)中多糖含量具有明顯差異，6月采收整體含量較高，為1.78%～1.82%。正常對(duì)照組和精制多糖大劑量組小鼠出血時(shí)間分別為(6.73±1.21)，(4.91±1.58) min(P<0.01)；正常對(duì)照組和精制多糖中、大劑量組小鼠凝血時(shí)間分別為(7.27±2.09)，(3.96±1.78)，(3.27±1.61) min(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論 多糖是金耳環(huán)止血的活性物質(zhì)；金耳環(huán)用于止血以6月采收為宜。

金耳環(huán)，貴州產(chǎn)；采收期；多糖；止血作用

金耳環(huán)為馬兜鈴科植物金耳環(huán)(AsaruminsigneD.)的干燥全草，主要分布在我國(guó)長(zhǎng)江以南各省區(qū)，具有溫經(jīng)散寒、祛痰止咳、散瘀消腫、行氣鎮(zhèn)痛的功能，含黃酮類、氨基酸、糖類和揮發(fā)油等成分[1]。在貴州三都水族集聚地，由于療效顯著，采集方便，金耳環(huán)被廣泛用于風(fēng)寒感冒、慢性支氣管炎、風(fēng)寒痹痛、跌打損傷、細(xì)菌性痢疾等癥候的治療[2-3]，《中國(guó)水族醫(yī)藥寶典》記載名為罵廣瓦[4]，民間多用于各種外部損傷引起的出血。研究表明植物多糖可能是止血作用的重要活性成分之一[5-8]，因而推測(cè)金耳環(huán)多糖可能具有一定的止血作用。有關(guān)其止血作用的活性成分研究筆者未見文獻(xiàn)報(bào)道，擬對(duì)金耳環(huán)多糖的止血作用及不同采收期多糖含量的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行探討，初步確定止血作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和適宜采收期，為黔產(chǎn)金耳環(huán)的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 動(dòng)物、試藥與儀器

1.1 動(dòng)物 無特定病原體(specefic pathogen free，SPF)級(jí)昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，由貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，使用許可證號(hào)：SCXK(黔)2003-0003，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(黔)2002-001。飼養(yǎng)在室溫 20 ℃、相對(duì)濕度 60%的清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。

1.2 試藥 葡萄糖對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110833-200904)；酚磺乙胺片(張家口云峰制藥廠，批號(hào)：H13024449，每片0.25 g)；其他試劑均為分析純。金耳環(huán)藥材于2012年4 ～ 9月采于貴州三都水族自治縣境內(nèi)，經(jīng)本校藥學(xué)系朱文仁副教授鑒定為金耳環(huán)(AsaruminsigneD.)正品。

1.3 儀器 Cary 100型雙光束紫外可見分光光度計(jì)(安捷倫科技有限公司)；AE 240型十萬分之一電子天平(瑞士Mettler公司)；DW-60W156型超低溫冰箱(青島海爾集團(tuán)公司)；DHG-9240A型真空干燥箱(上海金山公司)；2.0R型大容量低速離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 金耳環(huán)多糖的提取與精制 60 ℃恒溫干燥藥材，精密稱定10 g，石油醚回流脫脂3次。揮去石油醚，在液固比10：1，提取溫度80 ℃的條件下加水回流提取2次，每次90 min。合并提取液，濾過，放冷，4 000 r·min-1離心5 min，取上清液，凍融除雜3次，Sevage法除蛋白，活性炭脫色。濾過，濾液用90%乙醇沉淀，靜置24 h，除去上清液，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚多次洗滌，于60 ℃真空干燥，即得金耳環(huán)精制多糖，稱質(zhì)量后計(jì)算得率(mg·g-1)[9-10]。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 葡萄糖對(duì)照品105 ℃干燥至恒質(zhì)量，精密稱定10 mg，置100 mL量瓶中，純化水溶解并定容，配制成100 mg·L-1儲(chǔ)備液。精密吸取0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL儲(chǔ)備液分別加入具塞試管中，加純化水補(bǔ)至2.0 mL，配制成5，10，20，30，40，50 mg·L-1葡萄糖對(duì)照品系列溶液。另取純化水2.0 mL作為空白對(duì)照。向上述葡萄糖系列對(duì)照品溶液及純化水中各加入5%苯酚溶液1.0 mL，混勻，迅速沿管壁加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，封口，室溫放置30 min。在496 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，葡萄糖對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=136.107 2C-0.663 8(r=0.999 6)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照品溶液在5～50 mg·L-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3 換算因子的測(cè)定 2012年4月15日采收金耳環(huán)提取所得的精制多糖于60 ℃干燥至恒質(zhì)量，精密稱取20 mg，置于100 mL量瓶中定容。再吸取上述溶液1.0 mL定容至10 mL，得樣品1多糖溶液。吸取上述溶液2.0 mL，按“2.2”項(xiàng)方法顯色后，在波長(zhǎng)496 nm處測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算換算因子：f=W/(C×D)。式中：W為多糖質(zhì)量(mg)，C為多糖溶液中葡萄糖的濃度(μg·mL-1)，D為多糖的稀釋倍數(shù)。測(cè)得換算因子f=1.201 7。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取樣品1多糖溶液1.0 mL，按測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，連續(xù)測(cè)定6次，其吸光度平均值0.135 3，RSD為0.94%。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取樣品1多糖溶液1.0 mL共6份，分別置于20 mL試管中，各精密加入10 μg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，按“2.2”項(xiàng)方法操作，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為98.73%，RSD為1.12%。

2.6 同生長(zhǎng)期金耳環(huán)多糖的含量測(cè)定 精密稱取不同采收時(shí)間金耳環(huán)精制多糖各10 mg，定容于50 mL量瓶中，再吸取上述溶液1.0 mL定容至10 mL，搖勻得樣品溶液。精密吸取樣品溶液1.0 mL，按“2.2”項(xiàng)方法操作，測(cè)定多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)并按下式計(jì)算原藥材中多糖含量。測(cè)定結(jié)果見表1。

多糖含量(mg·g-1)=精制多糖得率(mg·g-1)×多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)。

表1 不同采收期金耳環(huán)多糖含量的動(dòng)態(tài)變化

Tab.1 Dynamic changes of polysaccharide content in Asarum insigne from different harvest periodn=3

2.7 金耳環(huán)多糖止血作用

2.7.1 供試溶液的制備 酚磺乙胺溶液：取酚磺乙胺粉末2.15 g，加入純化水100 mL即得。多糖溶液：稱取2012年4月15日采收金耳環(huán)提取所得的精制多糖適量，使用時(shí)加純化水配成小、中、大3個(gè)劑量。

2.7.2 小鼠出血時(shí)間的測(cè)定 取昆明種小鼠50只，雌雄各半，按數(shù)字表法隨機(jī)分成正常對(duì)照組，酚磺乙胺組和多糖小、中、大劑量組，共5組，每組10只，分別灌胃給予0.9%氯化鈉溶液，酚磺乙胺和小、中、大劑量(210，420，840 mg·kg-1)金耳環(huán)多糖溶液，給藥體積為20 mL ·kg-1，每天1次，連續(xù)灌胃5 d，末次給藥1 h后用解剖剪距小鼠尾尖3 mm處橫向剪斷，待血液自行溢出計(jì)時(shí)，每30 s用濾紙吸血1次，直至血液自然停止，所需的時(shí)間即為出血時(shí)間[11]。

2.7.3 小鼠凝血時(shí)間的測(cè)定 取昆明種小鼠50只，雌雄各半，動(dòng)物分組、給藥劑量、給藥途徑均同上。末次給藥1 h后用毛細(xì)管于小鼠左眼內(nèi)球后靜脈叢取血，滴兩滴在玻璃片上并同時(shí)計(jì)時(shí)，每30 s用清潔大頭針在玻片上挑血液一次，觀察是否有凝血絲，記錄從出血至出現(xiàn)凝血絲的時(shí)間即為凝血時(shí)間[11]。

2.7.5 金耳環(huán)多糖對(duì)小鼠出血、凝血時(shí)間的影響 結(jié)果見表2。

表2 不同劑量金耳環(huán)精制多糖對(duì)小鼠出血、凝血時(shí)間的影響

Tab.2 Effect of refined polysaccharide in Asarum insigne at different doses on bleeding and coagulation time of mice min

與正常對(duì)照組比較，t=6.11，*1P<0.01，t=6.95，*2P<0.01，t=2.66，*3P<0.05，t=2.89，*4P<0.01，t=4.79，*5P<0.01

Compared with normal control group，t=6.11，*1P<0.01，t=6.95，*2P<0.01，t=2.66，*3P<0.05，t=2.89，*4P<0.01，t=4.79，*5P<0.01

3 討論

止血作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，酚磺乙胺組和精制多糖大劑量組小鼠出血時(shí)間均顯著縮短(均P<0.01)，精制多糖小劑量組和中劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；酚磺乙胺組、精制多糖中劑量組及大劑量組小鼠凝血時(shí)間均顯著縮短(P<0.05或P<0.01)，說明金耳環(huán)精制多糖具有一定的止血作用，且與劑量相關(guān)。考慮到金耳環(huán)中尚含有黃酮類、氨基酸和揮發(fā)油等化學(xué)成分，因而不能確定多糖是其止血作用的唯一活性物質(zhì)，其止血的作用機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。

不同采收期金耳環(huán)多糖含量的動(dòng)態(tài)變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采收時(shí)間對(duì)多糖含量影響顯著。隨著植物的生長(zhǎng)，多糖含量變化呈先升后降的趨勢(shì)，以6月下旬采收最高，9月下旬采收最低，6月期間整體含量較高，提示實(shí)際應(yīng)用及藥物制劑開發(fā)時(shí)，如金耳環(huán)止血以多糖類成分為主，為使制劑生產(chǎn)獲得較多的活性多糖量，建議6月采收為宜。

[1] 中華本草編委會(huì).中華本草(第8 卷)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999：504-505.

[2] 田庚元，馮宇澄，林潁.植物多糖的研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志，1995，20(7)：441-444.

[3] 申利紅，王建森，李雅，等.植物多糖的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27(2)：349-352.

[4] 司有奇，陸龍輝.中國(guó)水族醫(yī)藥寶典[M].貴陽：貴州民族出版社，2007：318.

[5] 王梅，張麗娟，李瑾，等.生地黃湯不同制備方法多糖含量變化及止血作用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(12)：115-117.

[6] 武桂娟，劉泓雨，王紅，等.白芨多糖對(duì)正常小鼠出、凝血時(shí)間影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].黑龍江中醫(yī)藥，2011，(3)：49-50.

[7] 杜鵑，許啟泰.玉米須多糖的止血作用研究[J].河南醫(yī)學(xué)研究，2011，20(4)：398-400.

[8] 王玉挺，宋祖軍，王偉，等.多聚糖止血顆粒對(duì)兔股動(dòng)脈出血的止血效果觀察[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，10(11)：1855-1857.

[9] 魏學(xué)軍，林先燕，李雪營(yíng)，等.民族藥金耳環(huán)總多糖的提取工藝優(yōu)選[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(10)：41-44.

[10] 魏學(xué)軍，林先燕，夏亞蘭，等.民族藥金耳環(huán)多糖的提取和含量測(cè)定[J].井岡山大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，33(6)：86-88.

[11] 李儀奎.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2006：684.

DOI 10.3870/yydb.2015.05.010

Change of Polysaccharide fromAsaruminsigneinGuizhouDuring Different Harvest Period and the Hemostatic Effect of Polysaccharide Study

WEI Xuejun，XIA Yalan，LIN Xianyan，LI Xueying，YU Yuesheng

(DepartmentofPharmacy,QiannanMedicalCollegeforNationalities，Duyun558003，China)

Objective To study the change of polysaccharide fromAsaruminsigneinGuizhouduring different harvest period and its hemostatic effect. MethodsAsaruminsignepolysaccharide was extracted by water isolation and alcohol precipitation.We measured the polysaccharide content by UV spectrophotometry and detected the bleeding and clotting time by tail cutting and slide methods in mice. Results There was significant variation in polysaccharide ofAsaruminsigneat different harvest time, which was at a higher level in June(1.78%-1.82%).The bleeding time in mice of normal control group was (6.73±1.21) min，and that in mice treated with refined polysaccharide at high dose was (4.91±1.58) min，the difference between two groups was statistically significant(P<0.01).The clotting time in mice of normal control group was (7.27±2.09) min，and that in the refined polysaccharide at middle and high dose groups was (3.96±1.78) min and (3.27±1.61) min，respectively(P<0.05 orP<0.01). Conclusion The polysaccharide is an active hemostatic substance inAsaruminsigneand the optimum harvest time of it is in June for the clinical use.

AsaruminsigneinGuizhou；Harvest time；Polysaccharide；Hemostatic effect

2014-03-10

2014-05-12

*貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)專項(xiàng)資金項(xiàng)目[黔省專合字(2010)156號(hào)]；貴州省黔南州科技局資金項(xiàng)目[黔南科合社字(2010)18號(hào)]

魏學(xué)軍(1972 -)，男，四川成都人，副教授，學(xué)士，從事中藥及民族藥開發(fā)應(yīng)用研究。電話：0854-8308038，E-mail：qndywxj@163.com 。

R282.71；R285.5

A

1004-0781(2015)05-0606-03