大孔吸附樹脂純化裸花紫珠總黃酮的工藝優選*

劉勇，張鵬威，蘇文琴，劉曉，鞏克明，項妮

(1.溫州醫科大學附屬第二醫院藥劑科，溫州 325027；2.海南醫學院藥學院，海口 571199；3.浙江省溫州市中醫院，溫州 325000；4.鹽城衛生職業技術學院，鹽城 224005)

·藥物制劑與藥品質量控制·

大孔吸附樹脂純化裸花紫珠總黃酮的工藝優選*

劉勇1，張鵬威2，蘇文琴2，劉曉3，鞏克明4，項妮2

(1.溫州醫科大學附屬第二醫院藥劑科，溫州 325027；2.海南醫學院藥學院，海口 571199；3.浙江省溫州市中醫院，溫州 325000；4.鹽城衛生職業技術學院，鹽城 224005)

目的 優選裸花紫珠總黃酮的大孔吸附樹脂純化工藝。方法 以總黃酮的吸附率和洗脫率為指標，采用靜態吸附優選AB-8 、D-101、HP-20、HP2MG等大孔吸附樹脂的型號；通過單因素實驗優選裸花紫珠的動態吸附分離參數。結果 HP-20型樹脂的吸附效率較高，其最佳的純化工藝為pH 3.0的4.46 mg·mL-1裸花紫珠提取液，以3 BV·h-1流速上樣，3 BV·h-1水洗1 h，再用75%乙醇4 BV，以2 BV·h-1流速進行洗脫，經大孔吸附樹脂純化后的裸花紫珠總黃酮的平均純度可達47.4%。結論 HP-20型大孔吸附樹脂適用于裸花紫珠總黃酮的初步純化。

裸花紫珠；總黃酮；大孔吸附樹脂

裸花紫珠(CallicarpanudifloraHook.et Arn.)為馬鞭草科紫珠屬植物的干燥地上部分，主要分布于我國廣東、廣西、海南等地，具有抗菌、止血、散瘀消腫之功效，主治各種炎癥、外傷出血、跌打腫痛、風濕腫痛、肺結核咳血、胃腸出血等癥[1 ]。文獻報道裸花紫珠有效成分主要為總黃酮，如紫珠萜酮、芹菜素、木犀草素、槲皮素、蘆丁及其配糖體等黃酮類物質[2-3]。據悉目前上市的裸花紫珠制劑的提取工藝主要為水煎煮提取，定量質量控制主要以蘆丁作為對照測定總黃酮[4]。然而目前裸花紫珠水提取物中總黃酮的含量較低，為了提高總黃酮含量，減小服用劑量，筆者采用大孔吸附樹脂法純化裸花紫珠總黃酮，考察了提取工藝參數，為裸花紫珠制劑開發提供科學依據。

1 儀器與試藥

UV-1600紫外分光光度計(天津拓普) 。AB-8 和D-101大孔吸附樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司，批號分別為20100825，20101106)，HP-20和HP2MG(日本三菱公司，批號分別為20101203，20101015)，蘆丁(供含量測定用，中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-200707)，其他試劑均為分析純。裸花紫珠水提取浸膏由海南九芝堂藥業有限公司提供(批號：20120302)，浸膏含水量為39.2%。

2 方法與結果

2.1 裸花紫珠總黃酮含量測定

2.1.1 標準曲線的繪制 精密稱取蘆丁對照品10 mg，置50 mL量瓶中，加60%乙醇溶解并稀釋到刻度，得蘆丁對照品儲備液。精密吸取0，1，2，3，4，5，6 mL蘆丁對照品儲備液，分別置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min。以第1管為空白對照，在507 nm波長處測定吸光度，以吸光度(A)為縱坐標，質量濃度(C)為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程A=15.223C+0.000 2，r=0.999 1，蘆丁在8～48 μg·mL-1呈良好線性關系。

2.1.2 樣品測定 取裸花紫珠各樣品溶液(粗提液或洗脫液)，精密吸取適量溶液(1～6 mL)，照“2.1.1”項下方法，自“分別置25 mL量瓶中，各加水至6 mL”開始操作，測定各樣品溶液的A值，根據回歸方程計算總黃酮濃度[4]。

2.2 裸花紫珠提取物的處理 裸花紫珠水提浸膏用10倍質量的65%乙醇浸泡，放置過夜，抽濾，用適量65%乙醇洗滌濾渣，合并濾液，減壓蒸至無醇味，備用。測得裸花紫珠醇沉物的總黃酮含量為15.6%。醇沉浸膏臨用前用適量熱純化水稀釋。

2.3 樹脂的預處理 分別取商品大孔吸附樹脂AB-8、D-101、HP-20、HP2MG型大孔樹脂適量，于燒杯中加適量純化水浸泡24 h，2 mol·L-1鹽酸浸泡12 h，再用純化水洗至中性，2 mol·L-1氫氧化鈉溶液浸泡12 h，純化水洗至中性。最后用95%乙醇浸泡24 h，上柱，用95%乙醇洗脫，直至流出液和水混合無白色渾濁，再洗至無醇味[5]，備用。

2.4 靜態吸附實驗 取處理好的濕樹脂AB-8 、D-101、HP-20、HP2MG各10.0 mL(濕體積，下同)，置于4 只250 mL 錐形瓶，加入總黃酮濃度為13.39 mg·mL-1(相當于生藥材濃度為0.5 g·mL-1)的裸花紫珠醇沉物溶液100 mL，不停振搖24 h，濾過，用20 mL純水洗滌樹脂，洗液與濾液合并，測濾液中總黃酮含量，計算吸附量和吸附率。再加95%乙醇100 mL，振搖，放置24 h，使樹脂解吸附，濾過，樹脂用適量95%乙醇洗滌，合并濾液，測定溶液中總黃酮濃度，計算解析量和解析率。

吸附量=(吸附前樣品溶液的總黃酮量-吸附后樣品溶液中總黃酮量)/樹脂體積；吸附率(%)=(上樣液中總黃酮的量-吸附后樣品溶液中總黃酮量)/上樣液中總黃酮的量×100%；解吸量=(乙醇洗脫液中總黃酮的濃度×乙醇洗脫液的體積)/樹脂體積；解吸率(%)=解吸量/解吸量×100%。結果見表1。

表1 4種樹脂對裸花紫珠總黃酮的靜態吸附

Tab.1 Static adsorption of total flavonoids fromCallicarpanudifloraHook.et Arn by four kinds of resins

樹脂類型吸附量/(mg·mL-1)吸附率/%解吸量/(mg·mL-1)解吸率/%AB-812.345.812.097.8D-10118.669.415.784.3HP-2020.174.919.396.3HP2MG18.468.817.695.5

2.5 動態吸附實驗 取處理好的濕樹脂AB-8 、D-101、HP-20、HP2MG各10.0 mL，分別置于4 只玻璃層析柱中，加入總黃酮濃度為13.39 mg·mL-1的裸花紫珠醇沉物溶液，以1 BV流速進行動態吸附，流出液每10 mL接收一份，每一份取適量，用鹽酸-鎂粉反應，并輔以TLC 薄層檢測流出液的黃酮類化合物，待鹽酸-鎂粉反應呈陽性時，停止上樣，記錄上樣量，用4 BV 水洗，收集水洗液，測定溶液中總黃酮的含量。再用95%乙醇洗脫，洗至洗液近無色，收集洗脫液于1 000 mL量瓶中，定容，測定溶液中總黃酮的含量。計算吸附量、吸附率、解析量和解析率。結果見表2。

表2 4種樹脂對裸花紫珠總黃酮的動態吸附

Tab.2 Dynamic adsorption of total flavonoids fromCallicarpanudifloraHook.et Arn by four kinds of resins

樹脂類型吸附量/(mg·g-1)吸附率/%解吸量/(mg·g-1)解析率/%AB-810.840.310.294.4D-10117.665.714.481.9HP-2019.472.417.992.3HP2MG17.364.716.494.4

由表1，2可知，4種型號樹脂中HP-20和HP2MG大孔吸附樹脂的吸附率較大，而且其靜態解吸率>95%，從動態吸附數據看出，HP-20的吸附率最高，結合樹脂成本和工藝的可操作性，選擇HP-20型大孔吸附樹脂。

2.6 上樣溶液pH的考察 黃酮類化合物為多羥基酚類，呈弱酸性，因此pH 對其吸附性能有一定影響。本實驗考察pH對吸附及解吸附的影響。分別將總黃酮濃度為13.39 mg·mL-1的裸花紫珠醇沉物溶液用鹽酸或氫氧化鈉溶液調節溶液pH至1.0，3.0，5.0，7.0，9.0。按“2.4”項同法操作，測定HP-20樹脂的吸附率和解吸率，結果見表3。可見，隨著pH的升高，總黃酮吸附率下降，在pH為1.0～3.0時，吸附率達到最大，且pH1.0和pH3.0之間差異無統計學意義，其原因可能是在低pH階段，黃酮呈分子型，有利于其吸附。考慮到酸性太強對設備的腐蝕和對環境的影響較大，故設計將裸花紫珠上柱液pH調至3.0。

表3 pH對吸附的影響

2.7 動態吸附和動態洗脫實驗 將裸花紫珠提取樣品溶液調節pH至3.0，以一定流速通過裝有HP-20樹脂的層析柱，測定流出液中黃酮類化合物濃度，繪制樹脂泄漏曲線。考察樣品溶液上柱濃度、上樣量等因素對樹脂吸附性能的影響。

以不同濃度乙醇對已吸附樣品的樹脂進行動態洗脫，考察最佳乙醇濃度、最佳洗脫體積等因素對樹脂解吸性能的影響，測定不同條件下解吸液中黃酮類化合物的濃度，確定最佳解吸條件。

2.7.1 樣品溶液濃度考察 將13.39 mg·mL-1樣品溶液100 mL 分別用純化水稀釋2 倍(6.70 mg·mL-1)、3 倍(4.46 mg·mL-1)、4 倍(3.35 mg·mL-1)、5 倍(2.68 mg·mL-1)，調節pH為3.0，分別通過5 根裝有HP-20大孔吸附樹脂20.0 mL的層析柱，流速2 BV·h-1，收集流出液，測定溶液總黃酮含量，結果13.39，6.70，4.46，3.35，2.68 mg·mL-1樣品溶液的吸附量分別為9.83，14.03，16.46，15.76，11.77 mg·mL-1，樹脂吸附量與樣品溶液濃度和體積有一定關系。在初始階段，樣品濃度降低，吸附量增大，隨后隨著樣品濃度的下降，吸附率反而降低。用HP-20大孔樹脂吸附裸花紫珠粗提液中的總黃酮，樣品溶液濃度為4.46 mg·mL-1時樹脂對黃酮吸附量最大，考慮到樣品濃度過低上樣時間也延長，故確定4.46 mg·mL-1為上樣溶液濃度。

2.7.2 上樣量的考察 將一定量4.46 mg·mL-1樣品溶液，調節pH為3.0，以2 BV·h-1流速通過裝有HP-20大孔吸附樹脂20 mL的層析柱，流出液每20 mL收集一次，測定各份流出液中總黃酮濃度，繪制泄漏曲線，結果見圖1。當上樣量為380 mL時，流出液中總黃酮含量處在迅速增大的拐點，所以用HP-20大孔吸附樹脂分離裸花紫珠提取液中的總黃酮時，最佳上樣量為380 mL，約為樹脂體積的19倍。

圖1 泄漏曲線

2.7.3 上樣流速考察 取pH為3.0的4.46 mg·mL-1的裸花紫珠提取液4份，每份380 mL，通過大孔樹脂色譜柱(樹脂體積20 mL，徑高比1：8)，分別以流速為2，3，4 BV·h-1上樣，收集上樣流出液，測定總黃酮含量。結果流速為2，3，4 BV·h-1上樣時，對應的流出液中總黃酮含量分別為0.373，0.386，0.992 mg·mL-1。結果表明當上樣流速達到4 BV·h-1時，流出液中總黃酮含量明顯增高。為了保證吸附完全和節省時間，選擇上樣流速為3 BV·h-1。

2.7.4 水洗體積考察 取pH為3.0的4.46 mg·mL-1裸花紫珠提取液380 mL，通過大孔樹脂色譜柱(樹脂體積20 mL，徑高比1：8)，分別以3 BV·h-1的流速進行動態吸附，然后水洗除雜，每一0.5 BV收集一份水提液，用鹽酸-鎂粉反應，并輔以薄層色譜檢測流出液的黃酮類化合物，結果顯示水洗液中未檢出總黃酮，至3 BV時，洗出液溶液顏色近無色，為防止總黃酮流失和節省時間，故確定水洗除雜體積為3 BV。

2.7.5 洗脫乙醇濃度考察 取已處理的HP-20型吸附樹脂5 份，每份20 mL，分別加pH為3.0的4.46 mg·mL-1裸花紫珠提取液380 mL，以3 BV·h-1流速上樣，用3 BV水以3 BV·h-1水洗，再分別用10%，30%，50%，75%，95%乙醇各40 mL，以1 BV·h-1流速進行洗脫，分別收集洗脫液，20 mL為一瓶，測定總黃酮含量。結果吸附率分別為78.2%，79.3%，77.7%，79.4%，79.5%；洗脫率依次為18.2%，67.5%，70.4%，92.3%，96.4%。結果說明隨乙醇濃度的增大，洗脫率逐漸增大，到75%以后，洗脫率基本穩定在92%以上，從節約成本角度出發確定洗脫液濃度為75%。

2.7.6 洗脫速率考察 取已處理的HP-20型吸附樹脂5 份，每份20 mL，分別加pH為3.0的4.46 mg·mL-1裸花紫珠提取液380 mL，以3 BV·h-1流速上樣，以3 BV·h-1水洗，再用75%乙醇分別以1，2，3 BV·h-1流速洗脫，收集過柱液并記錄體積，測定總黃酮含量。結果總黃酮吸附率分別為79.2%，76.8%，79.4%；洗脫率依次為93.3%，92.0%，87.8%。說明洗脫速率對樹脂的洗脫率有一定影響，1 和2 BV·h-1之間并不很明顯，故確定最佳洗脫速率為2 BV·h-1。

2.7.7 洗脫曲線的繪制 取已處理的HP-20型吸附樹脂20 mL，分別加pH為3.0的4.46 mg·mL-1裸花紫珠提取液380 mL，以3 BV·h-1流速上樣，用3 BV水以3 BV·h-1水洗，用濃度為75%乙醇溶液，以2 BV·h-1流速進行洗脫，每10 mL收集1份洗脫液，測定總黃酮含量，繪制洗脫曲線，見圖2。4 BV終點已經檢測不出總黃酮。

圖2 總黃酮洗脫曲線

2.7.8 驗證實驗 取已處理的HP-20型吸附樹脂40 mL，分別加pH為3.0的4.46 mg·mL-1裸花紫珠提取液720 mL，以3 BV·h-1流速上樣，以3 BV·h-1水洗，用濃度為75%乙醇溶液，以2 BV·h-1流速進行洗脫，收集洗脫液，50 ℃減壓回收乙醇，60 ℃減壓干燥成干浸膏，測定浸膏中總黃酮含量，計算總黃酮回收率及含量，見表4。其中回收率(%)=浸膏中總黃酮的量/上樣液中總黃酮的量×100%；含量(%)=浸膏中總黃酮的量/浸膏的質量×100%。

表4 驗證實驗

Tab.4 Verification test %

2.7.9 樹脂重復使用實驗 用新處理的同一根樹脂柱，按以上確定的工藝上樣、水洗、乙醇洗脫，用4 BV純水沖洗樹脂柱后，重復以上操作6次，測定總黃酮回收率和含量。見表5，可見樹脂重復使用4次以后總黃酮回收率急劇降低，因此確定樹脂重復使用4次就需要再生處理。

表5 樹脂重復使用實驗

Tab.5 Test of resin reuse %

本實驗選用HP-20大孔吸附樹脂分離裸花紫珠總黃酮，純化裸花紫珠的工藝為pH為3.0的4.46 mg·mL-1裸花紫珠提取液720 mL，以3 BV·h-1流速上樣，以3 BV·h-1水洗，用濃度為75%乙醇溶液，以2 BV·h-1流速進行洗脫，洗脫率可達94%，總黃酮含量平均提高3.1倍，達到47.4%。

3 討論

本實驗方法分離裸花紫珠總黃酮的含量離《藥品注冊管理辦法》附件規定的“有效部位含量應占提取物的50%以上”尚有一定的差距。從本實驗的預實驗來看，若想提高含量可提高水洗量，或用低濃度乙醇洗脫，然而這樣會導致總黃酮損失過多，回收率降低，因此要想進一步提高裸花紫珠總黃酮含量需要進一步篩選對黃酮具有更好特異性的樹脂，或者將總黃酮粗品用溶劑萃取(如石油醚脫脂)后再上柱分離[6]。

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[3] 蔡金平，董琳，關薇薇.裸花紫珠的研究進展[J].現代藥物與臨床，2012，27(1)：60-61.

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[5] 朱浩，毛聲俊.大孔樹脂吸附純化不同中藥有效部位特性研究[J].中國中藥雜志，1998，2(10) ：607-609.

[6] 桑林，王曉林，鐘方麗.大孔吸附樹脂純化獨活總黃酮的工藝優選[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19(6)：57-60.

DOI 10.3870/yydb.2015.05.020

Optimization of Purification Technology for Total Flavonoids fromCallicarpanudifloraHook.et Arn.by Macroporous Adsorption Resin

LIU Yong1, ZHANG Pengwei2, SU Wenqin2, LIU Xiao3, GONG Keming4, XIANG Ni2

(1.DepartmentofPharmacy,theSecondHospitalAffiliatedtoWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China；2.SchoolofPharmacy,HainanMedicalUniversity,Haikou571199,China; 3.WenzhouHospitalofTraditionalChineseMedicine,Wenzhou325000,China; 4.YanchengInstituteofHealthSciences,Yancheng224005,China)

Objective To optimize purification technology for total flavonoids inCallicarpanudifloraHook.et Arm.by macroporous adsorption resin. Methods Macroporous resin models including AB-8, D-101, HP-20, HP2MG, were optimized by static adsorption and desorption experiments regarding to adsorption rate and desorption rate of total flavonoids.Purification technology parameters of total flavonoids were optimized by single factor test. Results HP-20 macroporous resin presented the best purification efficiency，the optimum purification conditions were that taking 4.46 mg·mL-1of total flavonoidsat pH 3.0,loading at 3 BV·h-1, washed with 3BV of water at 3 BV·h-1,then eluted with 4 BV 75% ethanol at 2 BV·h-1, finally obtaining the total flavonoids from the dry extract ofCallicarpanudifloraHook.et Arn.with the purity of 47.4%. Conclusion HP-20 macroporous resin is suitable for preliminary purification of total flavonoids inCallicarpanudifloraHook.et Arn.

CallicarpanudifloraHook.et Arn.; Total flavonoids; Macroporous Adsorption Resin

2014-01-06

2014-03-24

*海南省重點科技計劃項目(ZDXM20120095)；浙江省公益技術研究社會發展項目(2012C23082)；海南醫學院科研培育基金(HY2010-011)

劉勇(1974-)，男，浙江溫州人，藥師，碩士，主要從事中藥制劑開發。電話：0577-88002568，E-mail：153334048@qq.com。

張鵬威(1975-)，男，湖北羅田人，副教授，博士，主要從事藥物制劑開發和藥物質量標準研究。電話：0898-66894429，E-mail：zpw0803@163.com。

R282.71；TQ460.6

B

1004-0781(2015)05-0640-04