香菇多糖柱前衍生化高效液相色譜指紋圖譜研究*

陳志輝，譚麗容，羅明，黃綺敏，張美玲，魏剛

[1.廣州中醫藥大學，廣州 510006； 2.無限極(中國)有限公司，江門 529156]

香菇多糖柱前衍生化高效液相色譜指紋圖譜研究*

陳志輝1，譚麗容2，羅明1，黃綺敏2，張美玲2，魏剛1

[1.廣州中醫藥大學，廣州 510006； 2.無限極(中國)有限公司，江門 529156]

目的 建立香菇多糖1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜。方法 采用水提醇沉法提取香菇多糖，經三氟乙酸(TFA)水解和PMP柱前衍生后，HPLC 法測定香菇多糖的單糖組成。結果 在所建立的指紋圖譜中，共標示出13個特征共有峰，鑒別主要色譜峰6個，分別是甘露糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖、半乳糖、木糖和L-巖藻糖，其中葡萄糖比例最高，其次是甘露糖、半乳糖及巖藻糖。結論 該方法穩定、簡便、重復性好，可為香菇的質量控制提供參考。

香菇多糖；單糖；柱前衍生；色譜法，高效液相；指紋圖譜

香菇為香菇科香菇屬植物[Lentinusedodes(Berk.)sing.]的子實體，具有扶正補虛、健脾開胃、祛風透疹、化痰理氣、解毒、抗癌的功效[1]。香菇的化學成分包括香菇多糖、香菇嘌呤、核苷酸、蛋白質、礦物質、微量元素、維生素、揮發性成分及一定量的萜類物質等[2]。其中香菇多糖是主要有效成分之一，也是研究得較早和較多的多糖之一。現代藥理研究表明，香菇多糖具有抗腫瘤[3-4]、調節免疫[5-6]、抗氧化[7-8]、保肝[9-10]、降血糖[11]、降血脂[12]、抗病毒[13]等多種功效。多糖的單糖組成測定是控制多糖質量標準和提供基本信息的一項重要內容。柱前衍生化高效液相色譜(HPLC)法具有分離度高、操作快捷、重復性好等特點[14-15]。近年來，有關香菇多糖單糖組分的研究有少量報道[16-17]，但筆者尚未見采用柱前衍生化HPLC法的報道，故采用此法對香菇多糖的單糖組成指紋圖譜進行研究，旨在進一步為香菇化學成分和質量控制研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津 LC-20AT(DAD)高效液相色譜儀；T1000型萬分之一電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠)；HWS24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；TYXH-1 漩渦混合器(上海喬躍電子有限公司)；HC-3018 高效離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；TC-15 套式恒溫器(海寧市新華醫療器械廠)；電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)； ES1220-電爐(三角牌)。

1.2 試劑與材料 單糖對照品：D-葡萄糖(批號：110833-201205，含量≥99%)，D-甘露糖(批號：140651-200602，含量≥99%)，D-半乳糖(批號：100226-201105，含量≥99%)，D-鹽酸氨基葡萄糖(批號：140649-200702，含量：100%)，均購自中國食品藥品檢定研究院。L-鼠李糖(批號：121029，含量≥98%)，L-巖藻糖(批號：120927，含量≥98%)，D-葡萄糖醛酸(批號：121009，≥含量98%)，D-半乳糖醛酸(批號：121106，含量≥98%)，D-木糖(批號：121026，含量≥98%)，D-氨基半乳糖(批號：120927，含量≥99%)，D-核糖(批號：121012，含量≥98%)，D-阿拉伯糖(批號：121103，含量≥98%)，均購自上海融禾醫藥科技有限公司。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazalone，PMP，上海晶純生化科技股份有限公司，批號：A1216009，含量≥99%)，三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20120903，含量≥99%)；乙腈(德國 Merk 公司，色譜純)；磷酸氫二鈉(Na2HPO4)和磷酸二氫鈉(NaH2PO4)均系廣州化學試劑廠提供；水為純化水；其他化學試劑除特殊標明外均為分析純。香菇樣品XGS1-XGS6購自長洲菜市場，香菇樣品XGS7-XGS10由無限極(中國)有限公司提供，經廣州中醫藥大學魏剛研究員鑒定為香菇科香菇屬植物香菇的子實體。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 參考文獻[18]色譜條件，并經實驗確定分離度相對較好的色譜條件。色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-磷酸鹽緩沖液(0.1 mol·L-1，pH 6.7，體積比15.5：84.5)；柱溫30 ℃，檢測波長250 nm；流速0.8 mL·min-1；進樣體積10 μL。

2.2 對照品溶液的制備 分別取D-核糖、D-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-鹽酸氨基葡萄糖、L-巖藻糖、D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、L-鼠李糖、D-木糖對照品適量，精密稱定，加純化水制成單糖混合對照溶液(單糖濃度約0.45 g·mL-1)。精密吸取單糖混合對照品溶液100 μL置5 mL安瓿中，精密加入0.6 mol·L-1氫氧化鈉溶液100 μL，混勻，精密加入0.5 mol·L-1PMP 100 μL，在70 ℃條件下反應60 min，取出，放冷，精密加入0.3 mol·L-1鹽酸溶液200 μL，渦旋混勻，加水至1 mL，轉移至5 mL離心管中，渦旋混勻。加入三氯甲烷1 mL，渦旋混勻，3 000 r ·min-1離心10 min，棄去三氯甲烷層，如此至少重復3次，至三氯甲烷層無顏色，水層即得對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 香菇多糖溶液的制備 取本品粉末(50～60 ℃減壓干燥，粉碎，過孔徑0.425 mm 藥篩)1 g，精密稱定，加入80%乙醇100 mL，超聲處理1 h，取出，濾過，濾渣重復超聲處理1次。將濾渣連同濾紙置燒瓶中，加水100 mL，回流提取2 h，取出，趁熱濾過，殘渣加水100 mL，重新加熱回流1 h，趁熱濾過，用適量熱水洗滌殘渣和濾器，合并濾液與洗液，濃縮水提液至約10 mL，放冷，5 000 r ·min-1離心20 min，將上清液轉移至10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。轉移至離心管中，精密加入無水乙醇40 mL(慢加快攪)，置5～10 ℃冰箱中放置12 h，5 000 r ·min-1離心10 min，棄去上清液，沉淀加80%乙醇洗滌 2 次，每次10 mL，5 000 r ·min-1離心10 min，再加無水乙醇洗滌2次，每次10 mL，5 000 r ·min-1離心10 min，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉移至5 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得粗多糖溶液。

2.3.2 香菇多糖的TFA部分酸水解 精密吸取“2.3.1”項下樣品粗多糖溶液500 μL，置5 mL的安瓿中，精密加入0.4 mol·L-1TFA溶液500 μL，封口后置110 ℃條件下水解6 h，取出，放冷，水浴蒸干，加入甲醇1 mL攪拌，蒸干以去除TFA，如此重復至少3次，殘渣加熱水溶解，轉移至2 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得香菇粗多糖水解溶液。

2.3.3 PMP衍生化 精密吸取“2.3.2”項下的粗多糖水解溶液 200 μL置5 mL安瓶中，精密加入0.6 mol·L-1氫氧化鈉溶液200 μL，混勻，精密加入0.5 mol·L-1PMP溶液 200 μL，在70 ℃條件下反應60 min。取出，放冷，精密加入0.3 mol·L-1鹽酸溶液 400 μL，渦旋混勻。移至5 mL離心管中，加入三氯甲烷1 mL，渦旋混勻，3 000 r ·min-1離心10 min，棄去三氯甲烷層，如此至少重復3次，至三氯甲烷層無顏色，水層即得供試品溶液，用孔徑0.45 μm 微孔濾膜過濾，供HPLC進樣分析。

2.3.4 TFA酸水解時間的篩選 按“2.3.2”項下方法實驗，水解時間分別考察1，2，4，6，8 h，所得粗多糖水解溶液按“2.3.3”項下方法實驗，衍生時間為60 min。精密吸取供試品溶液各20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣分析。以供試品溶液所得 HPLC 圖譜主要共有特征峰的峰面積之和作為衡量指標，反應6 h時共有峰面積和達到最大，進一步篩選水解時間4，5，6，7，8 h，結果見圖1，可見隨著水解時間的延長，主要共有特征峰的峰面積之和隨之升高，當水解時間達6 h，水解完全，該點后峰面積和曲線開始下降，因此，確定水解時間為6 h。

2.3.5 PMP 衍生時間的篩選 按“2.3.2”項下方法實驗，取水解時間為6 h所得的粗多糖水解溶液按“2.3.3”項下方法實驗，衍生時間分別考察60，80，100，120及140 min，精密吸取所得供試品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，以所得 HPLC 圖譜主要共有特征峰的峰面積之和作為衡量指標，在所選時間范圍內峰面積之和變化不明顯，說明衍生反應60 min已基本完全。進一步篩選衍生反應時間20，40，60，80，100 min，結果見圖2，可見隨著衍生反應時間的延長，主要共有特征峰的峰面積之和隨之升高，衍生反應時間為60 min，多糖趨于反應完全，峰面積達到最大，當衍生反應時間超過60 min，曲線下降，因此，確定衍生反應時間為60 min。

圖1 不同水解時間對香菇多糖PMP-HPLC指紋圖譜共有峰面積之和的影響

Fig.1 Effect of different hydrolysis time on the sum of common peak area PMP-HPLC fingerprint for mushroom polysaccharides

圖2 不同衍生反應時間對香菇多糖PMP-HPLC指紋圖譜共有峰面積和的影響

Fig.2 Effect of different derivative time on the sum of common peak area PMP-HPLC fingerprint for mushroom polysaccharides

2.3.6 供試品溶液制備方法的確定 精密吸收“2.3.1”項中樣品粗多糖溶液500 μL，置5 mL安瓶中，精密加入0.4 mol·L-1TFA 溶液500 μL，封口后置110 ℃條件下水解6 h，取出，放冷，水浴蒸干，殘渣加入甲醇1 mL攪拌，蒸干以去除 TFA，如此重復至少3次，殘渣加熱水溶解，轉移至2 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得粗多糖水解溶液。精密吸取粗多糖水解溶液200 μL置5 mL安瓶中，精密加入0.6 mol·L-1氫氧化鈉溶液200 μL，混勻，精密加入0.5 mol·L-1PMP 200 μL，在70 ℃條件下衍生反應60 min。取出，放冷，精密加入0.3 mol·L-1鹽酸溶液400 μL，渦旋混勻。移至5 mL離心管中，渦旋混勻。加入三氯甲烷1 mL，渦旋混勻，3 000 r ·min-1離心10 min，棄去三氯甲烷層，如此至少重復3次，至三氯甲烷層無顏色，水層即得供試品溶液。

精密吸取與多糖水解溶液等量的水200 μL，按供試品溶液制備方法同法進行衍生處理，得溶劑空白對照。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度實驗 取衍生化后的同一批供試品溶液，連續進樣6次，考察各色譜峰相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果，各主要色譜峰的相對保留時間RSD<3%，相對峰面積RSD<5%，表明儀器的精密度良好。

2.4.2 穩定性實驗 取衍生化后的同一批供試品溶液，分別在0，2，4，6，10，24 h進樣檢測，考察各色譜峰相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果，各主要色譜峰的相對保留時間RSD<3%，相對峰面積RSD<5%，表明供試品溶液在考察的時間范圍24 h內具有較良好的穩定性。

2.4.3 重復性實驗 取同一批樣品6份，精密稱定，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別進樣檢測，考察各色譜峰相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果，各主要色譜峰的相對保留時間RSD<3%，相對峰面積RSD<5 %，表明重復性良好。

2.5 樣品測定 按照“2.3”項方法制備10批樣品的供試品溶液，按照“2.1”項色譜條件進行檢測。

2.6 指紋圖譜的建立與分析

2.6.1 混合單糖對照品分析 精密吸取“2.2”項中混合單糖對照品溶液20 μL，按“2.1”項色譜條件進樣分析得到色譜圖(圖3)，混合單糖對照品除氨基葡萄糖、核糖重疊外，其他9個成分能獲得較好的分離效果。

2.6.2 共有峰的確定及參照峰的選擇 按“2.3.6”項下制備10批樣品的供試品溶液，按“2.1”項色譜條件各進樣10 μL，按“2.1”項色譜條件進樣分析，結果不同批次樣品均具有基本一致的特征峰，共標示出13個共有峰。經對照品保留時間定位及色譜峰紫外光譜分析，鑒別6個色譜峰，即3號峰(甘露糖)、9號峰(葡萄糖醛酸)、10號峰(葡萄糖)、11號峰(半乳糖)、12號峰(木糖)、13號峰(巖藻糖)。以峰11(半乳糖)為參照峰(S)分別計算各特征共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表1，2。

1.甘露糖；2.氨基葡萄糖、核糖(重疊)；3.鼠李糖；4.葡萄糖醛酸；5.半乳糖醛酸；6.葡萄糖；7.半乳糖；8.木糖；9.阿拉伯糖；10.巖藻糖

圖3 混合對照HPLC色譜圖

1.mannose；2.amino glucose，ribose(overlapping)；3.isodulcite；4.glucuronic acid； 5.galacturonic acid glucose galactose；6.glucose；7.galactose；8.xylose；9.Arabia sugar；10.fucose

Fig.3 HPLC chromatogram of mixed control

2.6.3 相似度分析 采用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2004A版)，以均值法生成指紋圖譜共有模式，衍生試劑空白峰、10批樣品重疊圖及對照圖譜見圖4～6。以共有模式為對照分析樣品相似度，結果見表3，提示樣品多糖組成較穩定。

3 討論

3.1 香菇多糖提取方法的考察 實驗發現，香菇在水提過程中有較多泡沫，且易出現爆沸現象。采用80%乙醇超聲處理2次除雜質，同時在水提過程中應注意加入沸石并用較大的圓底燒瓶進行提取，以利于提取的順利進行。香菇中多糖含量較高，采用水提取2次，以提取完全，并經過篩選。

3.2 香菇多糖水解衍生條件的考察 本研究選擇TFA和PMP濃度分別為0.4 和0.5 mol·L-1[18]，并進行了不同水解時間和衍生時間的篩選。以共有峰面積和作為評價指標，得到最優的水解時間和衍生時間分別為6 h和60 min。

表1 10批香菇多糖共有峰相對保留時間

表2 10批香菇多糖共有峰相對峰面積

圖4 衍生試劑HPLC圖譜

圖5 10批香菇多糖樣品 HPLC 指紋圖譜重疊圖

Fig.5 HPLC overlapping fingerprint of ten batches of mushroom polysaccharides samples

1，2，4，5，6，7，8.待定；3.甘露糖；9.葡萄糖醛酸；10.葡萄糖；11.半乳糖；12.木糖；13.巖藻糖

圖6 香菇多糖樣品 HPLC 指紋圖譜共有模式

1，2，4，5，6，7，8.undetermined；3.mannose；9.glucuronic acid；10.glucose；11.galactose;12.xylose；13.fucose

Fig.6 Common pattern of HPLC fingerprint of mushroom polysaccharides

3.3 樣品指紋圖譜分析 本研究采用酸水解柱前衍生HPLC法測定香菇多糖的單糖組成，共標示出13個特征峰，鑒別了6個色譜峰。從糖組成上可以看出，香菇多糖中葡萄糖的比例最大，與文獻報道一致[16-17]，其次是甘露糖、半乳糖及巖藻糖等，而其他色譜峰的峰面積相對較低。10批供試品相似度>0.99，表明香菇多糖PMP柱前衍生HPLC指紋圖譜具有較好的穩定性和可控性，可作為香菇質量控制和評價指標的參考依據之一。

表3 香菇多糖HPLC指紋圖譜相似度結果

[1] 國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草(第3卷)[M].上海：上海科學技術出版社，1999：571-572.

[2] 何永，伍玉明，高紅東，等.香菇營養成分研究進展[J].現代農業科技，2010，23(1)：140-141.

[3] OOI V E C，LIU F.A review of pharmacological activities of mushroom polysaccharides [J].Int J Med Mushrooms，1999，1(1)：195-206.

[4] 張鵬，苗玉榮，劉春英，等.香菇多糖對Lewis肺癌小鼠VEGF的表達及MVD的影響[J].宜春學院學報，2008，30(6)：87-88.

[5] 蘆殿榮，祝彼得，蘆殿香，等.香菇多糖對正常小鼠以及免疫抑制小鼠免疫功能的影響[J].甘肅中醫學院學報，2004，21(4)：20-22.

[6] 羅若榮，林旭凱，蔡文德，等.香菇多糖對大鼠免疫調節作用的研究[J].現代預防醫學，2007，34(21)：4096-4097.

[7] 逯愛梅，于天貴.香菇多糖對谷氨酸損傷原代培養大鼠神經細胞保護作用的研究[J].中國老年學雜志，2008，28(4)：337-339.

[8] 逯愛梅，于天貴，李文杰，等.香菇多糖改善衰老小鼠學習記憶能力的抗氧化機制[J].中國老年學雜志，2011，31(4)：613-615.

[9] 孫設宗，孫欣，金波.香菇多糖對小鼠實驗性肝損傷保護作用的研究[J].現代預防醫學，2013，40(6)：1035-1036，1039.

[10] 鐘萍，孫延鵬，李萍，等.香菇多糖對酒精性肝損傷小鼠自由基及TNF-α含量的影響[J].山西醫科大學學報，2012，43(6)：401-404.

[11] 王慧銘，黃素霞，孫煒.香菇多糖對小鼠降血糖作用及其機制的研究[J].中國自然醫學雜志，2005，7(3)：181-183.

[12] 王慧銘，夏道宗，夏明，等.香菇多糖降血脂作用及其機制的研究[J].浙江中西醫結合雜志，2005，15(10)：599-602.

[13] 張福明，張淑芹，孫非，等.香菇多糖對流感病毒的抑制作用[J].長春中醫藥大學學報，2006，22(4)：11-12.

[14] 馬定遠，陳君，李萍，等.柱前衍生化高效液相色譜法分析多糖中的單糖組成[J].分析化學研究簡報，2002，30(6)：702-705.

[15] 楊興斌，趙燕，周四元，等.柱前衍生化高效液相色譜法分析當歸多糖的單糖組成[J].分析化學研究簡報，2005，33(9)：1287-1290.

[16] 王金華，何霞輝.香菇多糖的提取純化及成分分析[J].食用菌，1991，11(3)：14.

[17] 李健，劉寧，陣平，等.香菇多糖單糖組成及含量的測定方法研究[J].化學與粘合，2005，27(2)：71-74.

[18] 王浩豪.靈芝孢子粉多糖色譜指紋圖譜及其免疫活性譜效關系的研究[D].無錫：江南大學，2012：2-8.

[19] 汲晨鋒，季宇彬.高效毛細管電泳法測定香菇多糖中單糖的組成[J].化學與粘合，2006，28(4)：276-278.

DOI 10.3870/yydb.2015.05.022

HPLC Fingerprint of Mushroom Polysaccharides by Pre-column Derivatization

CHEN Zhihui1，TAN Lirong2，LUO Ming1，HUANG Qimin2，ZHANG Meiling2，WEI Gang1

(1.GuangzhouUniversityofTCM，Guangzhou510006，China；2.Infinitus(China)CompanyLimited，Jiangmen529156,China)

Objective To establish the chromatographic fingerprint of mushroom polysaccharides by 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone(PMP) pre-column derivatization. Methods The mushroom polysaccharides was extracted by hot distilled water, precipitated by alcohol, and hydrolyzed into monosaccharides by Trifluoroacetic Acid (TFA).The hydrolysate was derivatized with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP) and tested via HPLC to study the monosaccharide components in mushroom polysaccharides. Results Fingerprint was established with 13 common peaks, 6 peaks in which were identified as mannose,D-glucuronic acid,D-glucose, galactose, xylose andL-fucose.The glucose accounted for the most, followed by mannose, galactose and fucose. Conclusion Development of fingerprint chromatogram by HPLC is a stable, simple, and repeatable way, which can be applied to the quality control of mushroom polysaccharides.

Mushroom polysaccharides; Monosaccharide; Pre-column derivatization; Chromatography, high performance liquid; Fingerprint chromatogram

2014-07-08

2014-08-25

*廣東省部產學研結合項目(2012B090600025)

陳志輝(1987-)，女，湖南長沙人，碩士，從事創新中藥研究與指紋圖譜分析工作。電話：(0)13824448792，E-mail：czh198710@163.com。

魏剛(1969-)，男，四川內江人，研究員，博士生導師，碩士，從事創新中藥研究與指紋圖譜分析工作。電話：020-39358519，E-mail：weigang021@163.com。

R282.71；R284

B

1004-0781(2015)05-0649-06