匹伐他汀對野百合堿誘導大鼠肺動脈高壓的作用及其機制

周述博，張本斯

(大理學院人體解剖教研室，大理 671000)

匹伐他汀對野百合堿誘導大鼠肺動脈高壓的作用及其機制

周述博，張本斯

(大理學院人體解剖教研室，大理 671000)

目的 探討匹伐他汀在防治肺動脈高壓中的作用及其可能機制。方法 雄性斯潑累格·多雷(SD)大鼠50只，隨機分為5組(n=10)，分別為正常對照組、模型對照組、匹伐他汀預防組(1 mg·kg-1·d-1)和匹伐他汀大劑量(3 mg·kg-1·d-1)治療組、小劑量(1 mg·kg-1·d-1)治療組。除正常對照組外，其余4組均通過皮下注射野百合堿55 mg·kg-1，誘導大鼠形成肺動脈高壓。8周后，比較各組存活率、平均肺動脈高壓(mPAP)、血小板源性生長因子-B(PDGF-B)、Rac1mRNA的表達及白細胞介素-6(IL-6)分泌水平。結果 匹伐他汀預防組、正常對照組大鼠均存活，匹伐他汀小劑量治療組、大劑量治療組與模型對照組小鼠存活率分別為60.0%，80.0%，40.0%(P<0.01)；與模型對照組比較，匹伐他汀治療組mPAP均降低(均P<0.01)，肺組織PDGF-B表達、IL-6分泌及Rac1基因表達均降低(均P<0.01)。結論 匹伐他汀可能是通過對Rac1基因和PDGF-B表達的調節以抑制肺動脈平滑肌細胞增殖和抑制IL-6分泌等機制防治肺動脈高壓。

匹伐他汀；野百合堿;肺動脈高壓;血管平滑肌

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是在多種致病因素下使肺血管阻力增高及肺順應性減退并肺血管重塑，最終發展為右心衰竭的一種病理生理過程[1]，具體的發生機制尚不完全清楚，已證實多種體液因素如內皮素及生長因子等參與肺血管纖維化的發病過程，并使肺血管平滑肌細胞增殖。他汀類藥物已被證實具有抗血管平滑肌增殖、抗炎、抗凋亡作用，對小G蛋白翻譯后的修飾有抑制作用，可中斷細胞內信號的傳導[2]。小G蛋白是一種具有GTP酶活性且相對分子質量小的蛋白。Rac1是小G蛋白的一個亞群；血小板源性生長因子B(platelet-derived growth factor B，PDGF-B)在血管平滑肌增殖中起重要的調節作用；白細胞介素-6( interleukin-6，IL-6)是一種重要的炎癥遞質。匹伐他汀屬于他汀類新型調脂藥。筆者通過觀察Rac1、PDGF-B和IL-6變化，進一步闡明PAH形成及匹伐他汀對PAH的治療機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 雄性斯潑累格·多雷(Sprague Dawley，SD)大鼠，無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級，體質量(253.8±14.2) g，由昆明動物實驗中心提供，動物生產許可證號：SCXK(滇)2011-004，動物使用合格證號：0024150。野百合堿(上海純優生物有限公司，含量：98%，批號：P1014)，匹伐他汀鈣片(日本Kowa Company，Ltd，規格：每片2 mg，批號：20130101)，大鼠PDGF-B抗體(Bia-Swamp公司，批號：BSA-10308)，二抗及二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒(上海基爾頓生物制劑公司，批號：201310A)，IL-6酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(美國Rapidbio公司，批號：201310)，TRIZOL試劑(天根公司，批號：HG1310281004)，灌胃液均按每組設定的匹伐他汀的量用滅菌水稀釋至2 mL。大鼠右心導管(大理學院生理學教研室)，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增儀(德國Eppendorf公司)，熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司的7700型)。

1.2 動物分組與干預方法 大鼠50只，隨機分為5組，每組10只，分別為正常對照組、模型對照組、匹伐他汀預防組(1 mg·kg-1·d-1)和匹伐他汀大劑量(3 mg·kg-1·d-1)治療組、小劑量(1 mg·kg-1·d-1)治療組。除正常對照組外其余4組均通過皮下注射野百合堿55 mg·kg-1，誘導大鼠形成PAH[3-4]。其中匹伐他汀預防組自野百合堿皮下注射當日起每日給予匹伐他汀(1 mg·kg-1·d-1)灌胃至第8周末；匹伐他汀大劑量組(3 mg·kg-1·d-1)和小劑量組(1 mg·kg-1·d-1)在第4周末開始給予匹伐他汀相應劑量灌胃至第8周末。模型對照組和正常對照組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃至第8周末。

1.3 血流動力學測定 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，參照孫波等[2]介紹的方法，血流動力學測定主要記錄平均肺動脈壓(mean pulmonary artery pressure，mPAP)，用右心導管及生理記錄儀記錄。

1.4 肺動脈形態學觀察 取右中肺約200 mg，經石蠟切片、蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色后，顯微鏡下雙盲閱片，對肺小動脈管壁厚度進行統計學分析，每張切片均選取3～5個肺小動脈測量血管內外徑，其差值為血管壁厚度(wall thickness，WT)，血管壁厚度百分比=(管壁厚度×2)/外徑×100%，計算其平均值。

1.5 右心室肥厚的判斷 將心臟分離為右心室游離壁(right ventricular free wall，RV)和左心室加室間隔(left ventricle+ventricular septal，LV+S)，用濾紙吸干后稱其質量，計算RV/(LV+S)比值，判斷右心室的肥厚程度。

1.6 肺組織中PDGF-B免疫組化染色和結果判斷 取肺組織經石蠟切片后再免疫組化染色，依次脫蠟、抗原修復、用過氧化氫消除內源性過氧化物酶、滴加一抗、再滴加二抗、DAB顯色等步驟。以棕黃色反應物為陽性信號，每張切片選取直徑100～150 μm肺小動脈3～5支，染色深淺表示PDGF-B的表達強度。

1.7 RT-PCR法檢測肺組織Rac1的mRNA 引物合成由天根公司完成Rac 1引物序列：上游5′-CCTGCTCATCAGTTACACGAC- 3′，下游5′-GACGC-AGTCTGTCATAATCTT- 3′，擴增片段長度為180 bp。β-actin基因為內參照，上游5′-CACCCGCG-AGTACAACCTTC-3′，下游5′-CCCATACCCACCATC-ACACC-3′，擴增長度片段為244 bp。PCR過程按照說明書進行，擴增條件如下：①95 ℃、3 min預變性；②95 ℃、20 s變性，60 ℃、30 s退火延伸，40個循環。實時熒光定量PCR 分析：分別測定每個樣品Rac1和β-action mRNA 的Ct值，為了減少操作誤差，將每個樣品均作復孔。Ct值表示每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時經歷的循環數。采用相對定量方式表示各樣品Rac1的ΔCt。再按照ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt參照基因，計算2-ΔΔCt。在對PCR反應過程中的每一個循環的系統熒光強度進行實時監測的過程中，根據擴增曲線確定Ct值，利用2-ΔΔCt法計算Rac1相對拷貝數。

1.8 ELISA檢測肺組織中IL-6 取已凍存的肺組織100 mg，剪碎，取滅菌水0.9 mL稀釋勻漿后，2 000 r·min-1(r=3 cm)離心10 min，取上清液50 μL用于檢測，按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

2 結果

2.1 實驗動物一般狀況 匹伐他汀預防組、正常對照組大鼠均存活。正常對照組大鼠強壯、呼吸平穩；模型對照組、匹伐他汀小劑量治療組、匹伐他汀大劑量治療組大鼠在腹腔注射野百合堿1周后，3組大鼠較正常對照組均有不同程度活動減少，食量減少，至第 2 周末開始出現體質量下降，部分大鼠出現喘息，第 3 周末上述癥狀更嚴重，鼻、唇發紺，至第4周末時模型對照組和匹伐他汀大劑量治療組各死亡1只，匹伐他汀小劑量治療組死亡2只；匹伐他汀大劑量、小劑量治療組在4周末給予匹伐他汀治療后，大鼠呼吸逐漸平穩，體質量開始增加，并且大劑量治療組優于小劑量治療組；至8周末時模型對照組共死亡6只，匹伐他汀大劑量治療組死亡2只，匹伐他汀小劑量治療組死亡4只，匹伐他汀預防組和正常對照組無死亡。匹伐他汀小劑量治療組、大劑量治療組與模型對照組小鼠存活率分別為60.0%，80.0%，40.0%(χ2=2.326，P<0.01)。解剖死亡大鼠，可見胸腔積液，肺部有瘀點、瘀斑，且可見右心室游離壁明顯肥厚。

2.2 血液動力學測定和肺小動脈形態學、右心室肥厚判定 與正常對照組和匹伐他汀預防組、大劑量治療組、小劑量治療組比較，模型對照組mPAP值、肺小動脈管壁增厚程度及右心室肥厚程度顯著升高(1.476≤F≤13.264，均P<0.01)；匹伐他汀預防組、大劑量治療組、小劑量治療組上述指標組間比較均差異有統計學意義(2.481≤F≤10.259，均P<0.05)，見表1和圖1。

2.3 肺組織中PDGF-B的表達情況 與模型對照組比較，匹伐他汀大劑量治療組、小劑量治療組及預防組的PDGF-B基因表達均不同程度抑制，均明顯低于模型對照組(1.354≤F≤13.368，均P<0.01)，匹伐他汀大劑量治療組及小劑量治療組間比較上述指標差異有統計學意義(1.375≤t≤6.316，P<0.05)，見表1和圖2。

2.4 實時熒光定量PCR檢測及ELISA檢測結果 Rac1 mRNA的表達在正常對照組中較低，匹伐他汀預防組和大、小劑量治療組較高，模型對照組最高(2.489≤F≤14.264，均P<0.01)；IL-6的表達量同樣是模型對照組最高，各組值明顯降低(3.549≤F≤13.470，均P<0.01)，見表1。

表1 5組大鼠各觀察指標比較

組別大鼠數mPAP/mmHgWT/%RV/(LV+S)PDGF-BRac1mRNA陽性率%IL-6/(ng·L-1)正常對照組1017.32±1.21*118.87±3.12*10.34±0.01*112.92±2.470.97±0.12*135.69±3.62*1模型對照組1036.18±4.5157.01±4.380.55±0.0235.42±4.101.96±0.2587.49±5.28匹伐他汀預防組1024.20±2.31*135.37±2.15*10.37±0.01*119.30±3.62*11.57±0.28*154.38±2.37*1匹伐他汀 小劑量治療組1028.49±3.39*1*237.28±1.04*1*20.40±0.01*1*224.27±2.63*1*21.71±0.11*165.12±4.86*1 大劑量治療組1025.70±2.56*141.04±3.70*10.38±0.02*117.38±2.78*11.53±0.20*150.18±4.27*1

與模型對照組比較，*1P<0.01；與匹伐他汀大劑量治療組比較，*2P<0.05

Compared with model control group，*1P<0.01；compared with high-dose pitavastatin group，*2P<0.05

A.正常對照組； B.模型對照組； C.匹伐他汀預防組； D.匹伐他汀小劑量治療組； E.匹伐他汀大劑量治療組

A.normal control group；B.model control group；C.pitavastatin prevention group；D.low-dose pitavastatin group；E.high-dose pitavastatin group

Fig.1 Histopathology of pulmonary arteriole in five groups of rats(HE，×400)

A.正常對照組； B.模型對照組； C.匹伐他汀預防組； D.匹伐他汀小劑量治療組； E.匹伐他汀大劑量治療組

A.normal control group；B.model control group；C.pitavastatin prevention group；D.low-dose pitavastatin group；E.high-dose pitavastatin group

Fig.2 Immunohistochemical stain on PDGF-B in pulmonary tissue in five groups of rats(ISH，×400)

3 討論

PAH是臨床常見的病理生理過程，常繼發于心肺等多種疾病。隨著細胞和分子水平研究深入，目前對PAH發病機制及治療的研究有很大進展[5-6]。新的治療藥物及方法也逐漸增多，他汀類藥物就是其中的一種。他汀類藥物為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制藥，除具有較強的降脂作用外，還具有抗血管平滑肌細胞增殖、抗調亡、抗氧化及抑制炎性因子產生等作用[7-8]。匹伐他汀在治療PAH中的抗炎作用筆者尚未見報道。本研究結果證實，匹伐他汀可以減少肺組織中IL-6的分泌，從而產生抗炎作用，并能在一定程度上逆轉PAH的發生。IL-6作為一種炎癥遞質，在炎癥的發生、發展過程中有著重要地位[9]。目前，PAH發生機制雖未明確闡明，但認為IL-6可介導肺血管平滑肌免疫和炎性反應，并產生大量如C-反應蛋白等急性炎性反應產物；促進誘導型一氧化氮合成酶增加，使心肌環磷酸鳥苷水平升高，鈣內流減少，最終出現肺動脈彈性減退，所以在PAH進展中，由于各種因素導致炎癥反應，引起IL-6在肺組織分泌增加，而IL-6又可進一步損傷肺動脈，由此形成惡性循環。

研究顯示，他汀類藥物可以影響血管平滑肌細胞的增殖和遷移，且能有效治療PAH[10]。推測可能的機制是與其誘導肺動脈平滑肌細胞或血管內皮細胞凋亡、抑制靶細胞增殖有關，但是在PAH的進展中，有關對肺動脈平滑肌細胞增殖的細胞因子暫未具體闡明。在本實驗中，通過對各組大鼠肺組織PDGF-B表達量的測定，結果表明對已誘導形成PAH的大鼠肺組織PDGF-B的表達量較正常大鼠增多，由此推測，PDGF-B的表達增多在一定程度上促進肺動脈平滑肌細胞增殖。并且在使用匹伐他汀干預治療后，PDGF-B在肺組織中的表達量較模型對照組減少，進一步提示匹伐他汀能夠通過抑制PDGF-B的表達而逆轉PAH的進展。 PDGF-B 由巨噬細胞產生，主要促進細胞增殖及平滑肌纖維化[11]。所以可以推導，在PAH形成過程中，多種因素使肺組織產生炎癥反應、巨噬細胞增多，PDGF-B表達增加，從而使肺血管平滑肌細胞增殖。

Rho家族成員中的GTP激酶(Rho GTPases)是Ras GTP激酶(Ras GTPase)超家族的一個主要分支，目前在哺乳動物細胞中發現有8個亞群，共22種，Rac就是其中的一個亞群，并且Rac1是廣泛表達并且研究最多的亞型[12]。各種因素如低氧引起肺動脈平滑肌細胞Rac1激活，介導血管內皮細胞產生活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，ROS生成及肺動脈平滑肌細胞增殖促進PAH形成[13-14]。

筆者在本實驗中同時觀察Rac1與PDGF-B、IL-6，旨在進一步闡明PAH的進展和匹伐他汀治療PAH的具體機制。由實驗結果可以推測：在PAH發生的各種致病因素如低氧誘導肺血管的Rac1激活，進而介導細胞外向細胞內信號傳導，引起PDGF-B的表達，促進肺血管增殖及炎癥遞質如IL-6的產生而發生炎癥反應，導致肺血管重塑。另外研究表明[15]，低氧誘導Rac1激活，可介導ROS誘導內皮細胞核因子-κB1激活，活化的核因子-κB1可進一歩激活炎性因子IL-6，而IL-6又能誘導ROS的大量產生，形成惡性循環，導致血管內皮細胞炎性損傷，發生凋亡。本實驗結果也與此相符。但是在PAH的發生過程中，Rac1對肺組織中IL-6產生及PDGF-B的表達具體如何調控，還有待進一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2015.05.002

Effects and Mechanism of Pitavastatin on Monocrotaline-induced Pulmonary Arterial Hypertension in Rats

ZHOU Shubo,ZHANG Bensi

(TeachingandResearchSectionofHumanAnatomy，DaliCollege，Dali671000,China)

Objective To investigate the effects and mechanism of pitavastatin on monocrotaline (MTC)-induced pulmonary arterial hypertension (PAH) in rats. Methods A total of 50 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups (n=10 each)：pitavastatin treatment at low dose (1 mg·kg-1·d-1)，high dose (3 mg·kg-1·d-1)，pitavastatin prevention regimen (1 mg·kg-1·d-1), the model control, and the normol control group. PAH was induced by applying a single subcutaneous injection of MTC(55 mg·kg-1)in the first four groups of rats. The treatment lasted for 8 weeks.At the end of the study，survival rates and mean pulmonary arterial pressure(mPAP) among groups were compared.The expression levels of platelet-derived growth factor-B(PDGF-B)and IL-6,Rac1 mRNA in small pulmonary artery were also detected. Results All rats in the prevention protocol and normal control group survived.Pitavastatin treatment improved survival in the treatment protocol(P<0.01).The survival rate in the low dose, high dose, and model control group was 60.0%, 80.0%, and 40.0%, respectively.Pitavastatin in both prevention and treatment protocol significantly lowered mPAP (P<0.01).Pitavastatin also inhibited PDGF-B and IL-6 expression (P<0.01)，and inhibited Rac1 mRNA expression in lung tissues (P<0.01). Conclusion Pitavastatin reduces mPAP in the MTC-induced PAH rat model, the mechanism of which may be related to inhibition of Rac1 expression，smooth muscle cell proliferation and inflammatory mediator IL-6.

Pitavastatin; Monocrotaline;Pulmonary arterial hypertension; Vascular smooth muscle

2014-03-26

2014-06-20

周述博(1986-)，男，湖南邵陽人，醫師，碩士，研究方向：肺動脈高壓。電話：(0)18587201753，E-mail：43602984@qq.com。

張本斯(1969-)，女，云南梁河人，教授，研究方向：形態學基礎與臨床。電話：0872-2257104，E-mail：ben-si-zhang@163.com。

R972.6；R965

A

1004-0781(2015)05-0569-05