高效液相色譜法測定酒石酸泰樂菌素有關物質的研究

包潔華，張金霞，郭強功，張萍

（寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川750101）

高效液相色譜法測定酒石酸泰樂菌素有關物質的研究

包潔華，張金霞?，郭強功，張萍

（寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川750101）

依據歐洲藥典討論稿中酒石酸泰樂菌素有關物質的檢測方法，在280 nm波長處，以pH 5.5的磷酸鹽緩沖溶液－乙腈－水（10∶27.5∶62.5，V／V）為A流動相，以pH 5.5的磷酸鹽緩沖溶液－水－乙腈（10∶40∶50，V／V）為B流動相進行梯度洗脫，并對專屬性、準確度、精密度、檢測限和定量限、線性和范圍、耐用性、及溶液穩定性進行考察。結果顯示，雜質A、N、O、R、S峰峰面積與其對應濃度呈線性關系，其相關系數r均大于0.999，各項考察指標均符合要求。結果證明該分析方法能科學、合理的分析、控制酒石酸泰樂菌素有關物質，可以持續、準確地反映酒石酸泰樂菌素的特性。

高效液相色譜法；酒石酸泰樂菌素；梯度洗脫；有關物質

酒石酸泰樂菌素是一種畜禽專用抗感染和促生長的抗生素［1］，屬大環內酯類，主要對多數革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性球菌、厭氧菌及軍團菌、支原體及衣原體有良好效果［2］。廣泛應用于雞、牛、羊、豬的感染性疾病。《中華人民共和國獸藥典》中利用液相色譜法測定酒石酸泰樂菌素組分［3］，有關物質檢測方法尚無報道，產品中有關物質定性不全面。然而，隨著科技不斷進步和國際市場的競爭日益劇烈，對獸用抗生素的質量已經不再單一要求高組分和高含量，對產品中的雜質和殘留已經越來越受到廣泛關注。由于抗生素發酵過程中，細菌培養液中代謝產物的組分非常復雜，使用一般的液相色譜法進行分析時，雖然主要組分可以在相對比較短的時間內分離完畢，但有一些雜質組分往往得不到充分洗脫。本文參考歐洲藥典（EP）［4］和美國藥典（USP）［5］，研究并確立了梯度洗脫高效液相色譜法測定酒石酸泰樂菌素中的有關物質。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 高效液相色譜儀（島津LC－2010AHT）、CWA－VN3超純水機（北京普析通用儀器有限責任公司）、BSA224s電子分析天平（德國賽多利斯）。

1.2 試劑

1.2.1 酒石酸泰樂菌素標準品（批號：FOD333，來源：美國藥典委員會）、酒石酸泰樂菌素（批號：A91140702，由寧夏泰瑞制藥股份有限公司提供）、磷酸氫二鉀（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純）、乙腈（色譜純）。

1.2.2 pH 5.5的磷酸鹽緩沖溶液 取27.22 g磷酸二氫鉀于適量水中溶解，并用水稀釋至1000mL，再用34.84 g／L的磷酸氫二鉀溶液調節pH值至5.5±0.1。

2 方法與結果

2.1 液相色譜條件 島津LC－2010高效液相色譜儀，末端封尾C18色譜柱，規格4.6 mm×250 mm× 5μm，紫外檢測器，波長280 nm，柱溫60℃［4］，流速1.0 mL／min，以pH 5.5的磷酸鹽緩沖溶液－乙腈－水（10∶27.5∶62.5，V／V／V）為A流動相，以pH 5.5的磷酸鹽緩沖溶液－水－乙腈（10∶40∶50，V／V／V）為B流動相，梯度洗脫［6］程序如表1。

表1 梯度洗脫流動相比例變化

2.2 專屬性

2.2.1 空白溶液 流動相、水。

2.2.2 供試品溶液的制備 稱取供試品25.0 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，用流動相B溶解并定容至刻度，搖勻后用0.45μm濾球過濾。

2.2.3 對照品溶液的制備 對照溶液（a）：精密稱取5 mg酒石酸泰樂菌素標準品（包含泰樂菌素A，B，C和D組分，以及雜質A，N，O，R和S）用流動相B溶解并稀釋至5.0mL，搖勻后用0.45μm濾球過濾。

對照溶液（b）：準確移取1.0 mL供試品溶液置量瓶中，用水稀釋至100.0mL，再取1.0mL該溶液用水稀釋至10.0mL，搖勻后用0.45μm濾球過濾。

2.2.4 測定 精密量取空白溶液、對照品溶液與供試品溶液各20μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖至泰樂菌素A組分保留時間的1.4倍（圖1）。空白溶液對供試品雜質沒有干擾，同時供試品中雜質峰的相對保留時間與標準品中雜質峰的相對保留時間一致（表2）。

圖1 專屬性考察色譜圖

表2 專屬性考察數據

2.3 準確度 稱取酒石酸泰樂菌素供試品25.0mg置于50 mL量瓶中，用流動相B溶解并定容至刻度，精密量取20μL注入高效液相色譜儀，進樣2次，記錄色譜圖至泰樂菌素A峰保留時間的1.4倍。分別稱取酒石酸泰樂菌素標準品4、5、6mg置10mL量瓶中，用供試品溶液溶解并定容至刻度，相對濃度為80%、100%、120%。分別精密量取各溶液20μL注入高效液相色譜儀，各進樣3次，記錄色譜圖至泰樂菌素A峰保留時間的1.4倍。然后計算三個濃度下（80%、100%、120%）測試雜質的面積，測試結果及計算回收率結果見表3。三個濃度下（80%、100%、120%）測試雜質A、N、O、R、S面積回收率均在80%～120%，相對標準偏差均小于10.0%。

2.4 精密度 分別稱取酒石酸泰樂菌素供試品20.0、25.0、30.0mg，分別置于3個25mL量瓶中，用流動相B溶解，制備出濃度為80%、100%、120%的供試品溶液，同法制備3個濃度共9個供試品溶液，分別編號為1、2、3。精密量取各溶液20μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖至泰樂菌素A峰保留時間的1.4倍。按峰面積歸一化法計算三個濃度下（80%、100%、120%）測試選定雜質的允許差（即極差值），測試結果及計算結果見表4。三個濃度下（80%、100%、120%）測試選定雜質的允許差（即極差值）均不大于0.10%。

表3 供試品五種雜質A、N、O、R、S回收率結果

表4 五種雜質A、N、O、R、S重復性測試結果

2.5 檢測限和定量限

2.5.1 供試品溶液制備 稱取5 mg酒石酸泰樂菌素標準品用流動相B溶解并稀釋至5.0 mL，作為標準品溶液1（可以使用當日系統適用性溶液），編號為1，依次2倍稀釋至雜質A，N，O，R和S中最大雜質信噪比接近10∶1及3∶1（稀釋溶液依次編號為2、3、4…n），備用。

2.5.2 精密量取空白溶液、標準品溶液（1、2、3、4…n）各20μL注入高效液相色譜儀，各進樣1次，記錄色譜圖。分別計算色譜圖中對應峰信號響應值與空白溶液信號響應值的比值。計算以雜質A、N信噪比約為3∶1時的溶液濃度為0.03125 mg／m L即為檢測限，雜質O、R、S信噪比約為3∶1時的溶液濃度為0.06250 mg／mL即為檢測限，雜質A、O信噪比約為10∶1時的溶液濃度0.25 mg／m L即為定量限，雜質N、R、S信噪比約為10∶1時的溶液濃度0.125 mg／mL即為定量限。

2.6 線性和范圍 稱取酒石酸泰樂菌素標準品60.0 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，濃度為1.2 mg／mL，作為供試品溶液。分別吸取供試品溶液1.0、7.9、5.8、4.6、2.1、1.0 mL，配制成1.2、0.95、0.7、0.55、0.25、0.125 mg／mL濃度的線性溶液，按系統色譜條件檢測，記錄各雜質峰的峰面積。以雜質峰的峰面積對應供試品濃度做回歸曲線，數據及計算結果見表5。

表5 五種雜質A、N、O、R、S的線性曲線數據結果

2.7 耐用性和溶液穩定性考察 通過調整流動相流速1.00±0.05 mL／min、波長280±2 nm、pH值5.5±0.1，對雜質A、N、O、R、S進行檢查，結果的允許差均不大于0.10%。說明微小改變色譜條件適用于這五種雜質的檢測。對溶液穩定性進行考察，標準品溶液、供試品溶液分別在常溫放置0、12、24、48、60、72 h，取臨用新配標準品溶液進行檢測。測定的結果允許差（即極差值）均不大于0.10%。

3 討論與小結

本文參照歐洲藥典討論稿中酒石酸泰樂菌素有關物質檢測方法，討論稿中包括的雜質有A、N、O、R、S、E、G、H、I、J、Q共11種，本文中只對A、N、O、R、S進行了考察，其余雜質有待進一步考察。

歐洲藥典討論稿中試樣溶解用乙腈和水，梯度洗脫程序是0～25 min，流動相A 100%洗脫，25～45 min流動相A為100→84，流動相B為0→16，45～65 min時流動相A為84%，B為16%保持恒定，洗脫過程中色譜峰雜質的分離度達不到要求［3］（R≥1.5），調整梯度洗脫程序為0～20 min，流動相A 100%洗脫，20～45 min流動相A為100→84，溶劑調整為流動相B后色譜分離效果良好，不會產生因為溶劑與流動相不一致或者是相溶性差而導致的樣品析出再二次溶解的問題，避免出現色譜峰對稱性差甚至分叉的問題。

試驗中對室溫、30、40、50℃等條件進行了考察，色譜圖出峰時間延長，且柱壓明顯升高。另外，方法中對耐用性進行考察，包括調整流速1.00±0.05 mL／min、波長280±2 nm、pH值5.5± 0.1，結果的允許差均不大于0.10%。說明微小改變色譜條件適用于酒石酸泰樂菌素有關物質A、N、O、R、S的檢測。

酒石酸泰樂菌素的生產中除A、B、C、D組分外，雜質組分多，采用梯度洗脫能使雜質組分得到強有力的分離。

關于酒石酸泰樂菌素有關物質檢測方法目前沒有相關報道，本文建立了酒石酸泰樂菌素五種雜質A、N、O、R、S的檢測方法。五種雜質A、N、O、R、S在測定中均能獲得良好的線性曲線，該方法專屬性、準確度好，對更好地控制產品質量具有一定的實用價值。

［1］ 酒石酸泰樂菌素［Z］.農村養殖技術，2012，（9）.

［2］ 李樹綱，于清偉，張蕾，等.濁度法測定酒石酸泰樂菌素可溶性粉效價研究［J］.中獸醫醫藥雜志，2012，31（2）：33－35.

［3］ 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○一○年版（二部）［S］.

［4］ The Directorate for the Quality of Medicines＆Health Care of the Council of Europe（EDQM）.European Pharmacopoeia［S］.

［5］ The United States Pharmacopeial Convention.U.S.Pharmacopoeia，37th Revision［S］.

［6］ 張玉奎，王杰，張維冰，等.實用高效液相色譜法的建立［M］北京：華文出版社；2001：413－414.

（編輯：陳希）

Determ ination of Tylosin Tartrate Related Substances by HPLC

BAO Jie－hua，ZHANG Jin－xia?，GUO Qiang－gong，ZHANG Ping
（Ningxia TaiRui Pharmaceutical Co.，Ltd，Yinchuan 750101，China）

The determination method of tylosin tartrate related substances from EP discussion draft，At the wavelength of 280 nm，pH 5.5 phosphate buffer solution－acetonitrile－water（10∶27.5∶62.5，V／V）as the mobile phase A，pH 5.5 phosphate buffer solution－water－acetonitrile（10∶40∶50，V／V）as themobile phase B gradient elution，and the specificity，accuracy，precision，limit of detection and limit of quantification，linearity and range，durability，and solution stability was investigated.The results showed that the impurity A，N，O，R，S peak area and the corresponding concentration showed a linear relationship，the correlation coefficient r was greater than 0.999，the indicators are in line with inspection requirements.It was demonstrated that the method can scientific，reasonable analysis，control of tylosin tartrate related substances，It can be sustained，accurately reflect the characteristics of tylosin tartrate.

HPLC；tylosin tartrate；gradient elution；relevance substance

2014－10－29

A

1002－1280（2015）02－0035－05

S859.796

包潔華，從事抗生素生產質量管理工作。

張金霞。E－mail：371226727＠qq.com