水環境中致病微生物活的非可培養狀態研究進展

陳亨利，陳龍，康元環，莫金龍，單曉楓，李影

（吉林農業大學動物科學技術學院，長春130118）

水環境中致病微生物活的非可培養狀態研究進展

陳亨利，陳龍，康元環，莫金龍，單曉楓?，李影?

（吉林農業大學動物科學技術學院，長春130118）

細菌的“活的非可培養狀態（VBNC）”是指細菌在不良環境下形成的一種特殊狀態。常規檢測方法不能檢測出此狀態下的細菌，給食品安全、公共衛生帶來了隱患。現已發現的VBNC狀態細菌大多數是水生細菌，包括很多種致病菌。現對近些年水環境中致病微生物VBNC狀態的形成與檢測、生物學特性及復蘇的研究現狀進行綜述，希望能夠對VBNC狀態水生致病微生物引起疾病的防治起到積極作用。

活的非可培養狀態；水環境中致病微生物；檢測方法；生物學特性

活的非可培養狀態（viable but non－culturable state，VBNC），即細菌在不良環境條件下，細胞縮小成球形，常規培養方法不能生長繁殖，但仍具有代謝活性，并且在一定條件下能夠復蘇的特殊存活形式。許多革蘭氏陰性菌（G－）和一些不產芽孢的革蘭氏陽性菌（G＋）在不利于生長的條件下都可能進入活的非可培養狀態。

弧菌屬和氣單胞菌屬細菌是常見的水環境致病微生物，其中很多種都能夠進入VBNC狀態。常規方法不能檢測出進入VBNC的細菌，在此狀態下細菌仍保持著潛在的致病力［1］。因此魚塘中若存在VBNC細菌，條件適當時會發生相應水產疾病從而造成巨大經濟損失甚至危害人類生命健康。

一些學者已經開始關注VBNC狀態細菌對公共衛生的影響［1］，近年來分子生物技術和基因工程技術的應用與完善，推動了這一領域的研究。研究VBNC狀態對公共衛生、流行病學、微生態學等學科有著重要意義。本文對近年來水環境中致病微生物的VBNC狀態研究進展進行綜述。

1 活的非可培養狀態概述

1982年徐懷恕等［2］通過研究霍亂弧菌（Vibrio cholerae）和大腸埃希菌（Escherichia coli）的存活規律而首次提出了活的非可培養狀態這一概念。在VBNC狀態被報道之前，人們普遍認為細菌不再生長繁殖即為死亡狀態。而VBNC狀態的致病菌仍具有潛在的致病性，在適當條件下能夠復蘇，復蘇后仍然具有毒力［3］。至今已有報道的20個屬的60多種細菌能夠進入VBNC狀態［4］，許多水環境中的致病微生物都存在VBNC這一特殊狀態，如殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、殺魚巴斯德氏菌（Pasteurella piscida）、鰻弧菌（Vibrio anguillarum）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、創傷弧菌（Vibrio vulnificus）、熒光假單胞菌（Pseudomonadaceae Fluorescens）、惡臭假單胞菌（Pseudomonadaceae Putida）、遲鈍愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）等（表1）。許多研究人員正應用不同水環境致病菌進行VBNC實驗，以期發現更多能夠進入VBNC狀態的細菌。

表1 常見能夠進入VBNC的水環境致病菌種類［4］

2 水環境中致病微生物VBNC狀態的誘導

細菌世代中會受到許多環境方面的壓力，使細菌生長受到抑制進而轉變為一種類似休眠的特殊狀態，即VBNC狀態。Wolf和Oliver報導了細菌在包括低溫、寡營養和不同滲透壓等各種環境壓力下能夠進入VBNC狀態［5］。不同細菌進入VBNC需要的環境條件不盡相同，通常細菌處于不利于生長的環境下更容易進入VBNC狀態［6］。溫度和寡營養條件是誘導細菌進入VBNC狀態的主要因素。

2.1 溫度 溫度是影響細菌進入VBNC的重要因素之一，且常常伴有其他方面如營養條件的協同作用。大多數細菌，如弧菌，對低溫度較敏感［7］，僅有少部分細菌在較高溫度下能夠進入VBNC狀態，Rollins和Colwell［8］對空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）的研究發現，空腸彎曲桿菌在30℃條件下比在4℃條件下更快地進入VBNC狀態，Rahman等［9］通過對嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）的研究，發現25℃時的細菌存活數量比5℃要多。然而水環境中致病菌通常于30℃條件下培養，低溫對這些細菌的影響相對較弱，有些細菌如維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）甚至在4℃環境下仍能緩慢生長。這證明不是所有水環境中致病菌都會在低溫誘導條件下進入VBNC狀態，還有一部分細菌如溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）等，溫度對它們的影響較小。

2.2 營養條件 通常細菌在環境中長時間得不到充足的營養物質，便有可能會進入VBNC狀態。低溫度與寡營養共同作用會加速促進細菌進入VBNC狀態。Rahman等［9］將嗜水氣單胞菌于25℃，0.35%的NaCl溶液中培養50 d進入VBNC狀態。潘高山等［10］用湖水在室溫下培養溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria），僅4 d后就有90%的細菌進入VBNC狀態。上述研究表明，當環境營養水平低下時，水環境中致病菌會進入VBNC狀態以保持自身代謝活性。

2.3 其他因素 通常鹽度或滲透壓對腸道菌群影響較明顯，而對水生細菌影響相對較弱。光照和輻射會對水生致病菌產生一定的影響，但也與細菌種類有關，如Hoff等［11］的研究中，光對海水中的殺鮭弧菌（Vibrio salmonicida）及鰻弧菌（Vibrio anguillarum）沒有明顯影響。

3 水環境中致病微生物VBNC狀態的檢測

目前對VBNC細菌的檢測尚無統一標準，而利用平板計數法觀測可培養菌數是檢測的第一步。通過平板計數法確定可培養菌落數為零時，再根據以下方法對細菌是否進入VBNC狀態進行檢測。

3.1 活菌直接技術法 要檢測VBNC菌，首先要確定活菌數，只有可培養數為零而活菌數不為零的細菌才存在VBNC狀態。活菌直接計數法（direct viable counting，DVC）是目前常用的檢測方法之一。利用萘啶酮酸——一種DNA多聚酶抑制劑，刺激待檢菌液，由于DNA合成受到萘啶酮酸的抑制，菌液中的活菌只能生長而不能分裂。將萘啶酮酸添加入細菌培養物中，培養6 h后進行吖啶橙染色，熒光顯微鏡觀察，可觀察到活細菌變長，而VBNC狀態的細胞是橢圓形的［12］。

3.2 熒光顯微鏡檢測 熒光顯微鏡的一種快速檢測方法是使用LIVE／DEAD試劑盒進行檢測。LIVE／DEAD試劑盒基于細胞膜的完整性進行檢測，其中包含兩種熒光染料：SYTO－9和碘化丙啶（PI）。SYTO－9能夠滲透進入完整的細胞膜，將核酸染色，激發出綠色熒光；PI只能滲入破損的細胞膜，將核酸染色后激發出紅色熒光。在落射熒光顯微鏡鏡下，發出綠色熒光的為活細菌，發出紅色熒光的為死細菌［13］。此方法簡便快速，使用范圍廣泛，并且可配合流式細胞儀進行檢測。

3.3 分子生物學檢測 分子生物學方法具有很高的靈敏性和特異性，如果有適當的特異性引物，就能夠對樣本中的細菌DNA片段進行特異性擴增，這種方法不需要對細菌進行培養，能夠判斷不能進行培養的樣本中是否有細菌存在，然而卻不能檢測出細菌是否存活。相對于細菌的DNA，mRNA的半衰期非常短，僅有2～3min，因此可以用基于mRNA的檢測方法對細菌進行VBNC的判斷，可靠性很高。2012年潘樂等［14］利用RT－qPCR建立了VBNC狀態細菌的檢測方法，結果顯示良好。Gary等［15］應用RT－PCR聯合芯片雜交技術對弧菌的stx1基因進行VBNC檢測，結果表明此方法靈敏性、可靠性均較好。

3.4 基于細胞呼吸的檢測方法 判斷細菌是否為VBNC狀態的其他方法還有利用細菌的氧化還原能力進行檢測，5－氰基－2，3－二（4－甲基苯基）四唑氯化物（5－cyano－2，3－ditolyl tetrazolium chloride，CTC）是一種電子受體物質，細菌的呼吸過程能夠使無色的CTC還原為紅色。將一定濃度的CTC添加至細菌培養物中，避光條件下室溫培養，顯微鏡觀察或應用流式細胞儀進行檢測，能夠看到具有紅色熒光的細菌即為活細菌［16］。此方法操作簡便，但所有細菌是否都能降解CTC還不清楚［17］。

4 VBNC狀態水環境中致病微生物的生物學特性

4.1 VBNC時細菌形態變化 大多數進入VBNC的細菌都會發生程度不一的形態改變。且通常桿菌和弧菌會變短呈球桿狀甚至變為球狀。雖然細菌的形態發生了變化，但細菌結構沒有改變，細胞質、細胞膜、細胞壁、外膜仍然完整，并具有正常狀態下的表面蛋白、毒力因子。極少數細菌進入VBNC狀態后細胞完整性被破壞，Chiu等［18］觀察到黃色熒光蛋白（YFP）標記的副溶血弧菌骨架蛋白MreB在細菌進入VBNC狀態后降解為小片段。Zhong等［19］用透射電鏡觀察VBNC狀態的辛辛那提弧菌（Vibrio cincinnariens）發現內膜和外膜之間出現了較大空隙。杜萌等［20］在雞胚尿囊腔中成功復蘇了VBNC的遲鈍愛德華氏菌（Edwardsiella tarda），并用電鏡觀察，發現復蘇后的細菌形態與正常細菌沒有區別。上述研究表明當細菌復蘇后，其形態能夠恢復正常。

4.2 耐藥性 Ben等［21］的研究發現，正常、VBNC狀態和復蘇后的河流弧菌，藥敏試驗的結果幾乎一致。同樣地，其他一些學者對VBNC狀態的細菌研究證明正常細菌和VBNC狀態下以及復蘇后的細菌其耐藥性方面并無差異［22－23］。

4.3 致病性 進入VBNC的細菌會保留一部分毒力因子，因此有著潛在的毒力，復蘇后便會表達而發生疾病。有的細菌甚至在VBNC狀態仍具有致病性。Saux等［24］應用RT－PCR技術檢測VBNC狀態下的創傷弧菌（Vibrio vulnificus），檢測到了溶血毒素基因的mRNA，說明在VBNC狀態下溶血毒素基因仍在表達。Ben等［25］對溶藻弧菌的研究發現VBNC狀態下的溶藻弧菌具有致病性。鐘琳紅等［26］用RT－PCR檢測VBNC狀態哈維氏弧菌絲氨酸蛋白酶基因Ser和rpoS基因的表達，發現在VBNC狀態哈維氏弧菌未表達這兩種基因，而正常及復蘇后的細胞均能檢測到此兩種基因的表達，從而推斷這可能是哈維氏弧菌能長期保持致病性并持續爆發疾病的原因之一。

5 VBNC狀態水環境中致病微生物的復蘇

如果細菌的VBNC狀態是其維持生命的一種應答機制，那么VBNC狀態的細菌應該是能夠復蘇的。通常認為想要使VBNC狀態的細菌復蘇需要恢復適宜細菌生存的環境。有些細菌如弧菌僅僅使溫度上升就能夠使其恢復可培養能力，有些細菌則需要其他條件如添加營養物質，解除滲透壓等，或將非可培養細菌導入宿主內進行復蘇。Thomas等［27］將VBNC狀態的希利氏弧菌（Vibrio shiloi）和塔斯馬尼亞弧菌（Vibrio tasmaniensis）的培養條件恢復至20℃，兩種細菌均恢復了可培養能力；Morris等［28］將原綠球菌（Prochlorococcus）置于富營養環境時，可迅速生長；Baffone等［29］利用Balb／C小鼠作為宿主，成功復蘇了溶藻弧菌和哈維氏弧菌等海洋弧菌。此外，有些VBNC細菌的復蘇并不是一步完成的，Ben等［21］將VBNC狀態6年的河流弧菌進行復蘇，經過48 h培養后僅恢復了β－半乳糖苷酶和氧化酶活性，而繼續培養3個月后才恢復了正常河流弧菌的全部生物活性，并且復蘇后的細菌各種特性均與原菌相同。

但是，對于細菌是否為VBNC狀態復蘇生長抑或剩余可培養細菌生長而成，目前還存在一些爭論。Jiang等［30］通過對副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）升溫復蘇的研究認為，所謂的復蘇其實是殘存的可培養細菌重新開始生長；而Whiteside等［31］經過一系列稀釋、細菌重新生長時間及添加營養物質等試驗綜合分析，認為創傷弧菌（Vibrio vulnificus）確實存在著復蘇的現象。但由于VBNC狀態的復蘇機理尚不清楚，因此不同細菌復蘇條件不盡相同，甚至有些VBNC細菌還沒有成功復蘇的報道。1998年Mukamolova等［32］在藤黃微球菌的培養上清液中發現了一種復蘇促進因子（resuscitation－promoting factor，Rpf），這一發現可能是研究VBNC狀態細菌復蘇的關鍵，但在水生致病微生物領域鮮有應用Rpf進行復蘇的報道。

6 研究VBNC狀態對水環境中致病微生物檢測的意義及展望

VBNC狀態的水環境中致病菌在適當條件下能夠轉變成為正常細菌，并恢復其致病力。而常規檢測方法檢測不出處于這種特殊狀態的致病微生物，這就為病原的檢測、疾病的起因和防治研究提供了新的思路。例如當檢測魚塘中病原菌時，不僅要用傳統檢測方法來檢測，同時還應利用新興的VBNC病原菌檢測技術，以免一些細菌逃脫檢測而造成未來可能發生的疾病流行。

細菌VBNC狀態的出現，對食品安全、公共健康帶來了新的挑戰，能否檢測出VBNC狀態下的水環境中致病微生物，關系到人民群眾的生命財產安全。而在環境中，應用傳統微生物培養手段只能夠檢測出環境總病原菌中的小部分，而大多數細菌是以VBNC狀態存活，不能夠直接檢測出病原菌，因而給漁業帶來了隱患。研究細菌的VBNC狀態機制，能夠加深人們對細菌的了解，有利于進一步制定有效殺滅病原菌的措施。

VBNC狀態的發現對微生物學和微生態學來講也是一種機遇，近年來抑制性消減雜交技術（SSH）越來越多地應用于VBNC狀態基因差異的分析中，李文博等［33］應用抑制性消減雜交技術構建cDNA文庫，對鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium）進行了VBNC的鑒定，同樣地，這種技術也可以應用于水環境中致病微生物的VBNC檢測中。希望在不遠的將來，種種VBNC的檢測技術能夠發展成熟，從而在上市前的質檢環節斷絕VBNC狀態水生致病菌的隱性污染，為食品公共安全提供有力的技術保障。

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（編輯：陳希）

Progress in Research on Viable but Non －culturable State of Pathogenic M icroorganism in W ater Environment

CHEN Heng－li，CHEN Long，KANG Yuan－huan，MO Jin－long，SHAN Xiao－feng?，LIYing?
（College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

Bacteriamay form the exceptional and“viable but non－culturable（VBNC）”state under themalnourished environment.The VBNC state of bacteriamay notbe detected by conventional detectionmethod，bringing hazards to the food safety and public health.Most of the VBNC bacteria which have been discovered now are commonly aquatic bacteria，including many kinds of pathogenic bacteria.This paper describes the research of formation，detection，biological characteristics and recovery of pathogenic microorganism in water environment，which may play a positive role in prevention and control of diseases caused by the VBNC state of pathogenic microorganism.

viable but non－culturable；pathogenicmicroorganism in water environment；detectionmethod；biological characteristics

??杜萌.幾種常見致病菌的活的非可培養狀態研究［D］.中國海洋大學，2007.

10.7666／d.y1112118.

2014－12－08

A

1002－1280（2015）02－0052－06

S852.6

國家自然科學基金項目（31201927）

陳亨利，碩士，從事動物微生物學研究工作。

李影，E－mail：thliying＠163.com；單曉楓，E－mail：sxf1997＠163.com