“膚敏”膏對大鼠PCA模型T淋巴細胞及其亞群的影響

李靜平，李慶生，祁 燕

1云南中醫學院，云南 昆明 650500；2昆明醫科大學；3云南省中醫院

“膚敏”膏對大鼠PCA模型T淋巴細胞及其亞群的影響

李靜平1，李慶生2，祁 燕3

1云南中醫學院，云南 昆明 650500；2昆明醫科大學；3云南省中醫院

目的:研究“膚敏”膏對大鼠被動皮膚過敏反應（PCA）模型T淋巴細胞及其亞群的影響，探討其抗皮膚過敏作用機理。方法:用卵白蛋白建立大鼠PCA模型，采用免疫熒光流式細胞技術檢測PCA大鼠外周血CD3＋T、CD4＋T和CD8＋T細胞表達率及“膚敏”膏對3種細胞的影響作用。結果:與模型組比較，“膚敏”膏3劑量組CD3＋T和CD4＋T細胞表達率均值較模型組明顯升高（P＜0.05）。結論:“膚敏”膏的作用機理可能與其調節CD3＋T、CD4＋T的數量紊亂有關，從而間接的干預Th1/Th2細胞分化及平衡,在過敏反應早期調節細胞免疫平衡以阻斷病變進程。

大鼠PCA模型；T淋巴細胞及亞群；“膚敏”膏

“膚敏”膏是云南省名中醫李慶生教授在長期臨床實踐和科研工作中總結、結合文獻篩選確定的治療過敏性皮膚病的有效中成藥制劑。筆者在完成新藥臨床前各項系統研究并獲肯定藥效學資料的基礎上,開展“膚敏”膏的治療作用機理及關鍵作用靶點探索，為該中藥復方制劑的深層次研發奠定工作基礎。

C D3+T細胞分子可表達所有成熟T細胞，即代表所有成熟T細胞。而在成熟T細胞表面可分為C D4+T和C D8+T細胞兩個亞類。C D4+T細胞介導的細胞免疫可引起一系列皮膚炎癥發生，而C D4+T細胞進一步分為T h1和T h2兩細胞亞群，后者合成和分泌大量細胞因子進而吸引炎癥細胞趨向局部。故T h1/T h2細胞平衡失調是誘發過敏性皮膚病的重要因素。而C D4+T細胞為T h1/T h2細胞分化的前體細胞，C D4+T/C D8+T細胞平衡直接影響后續T h1/T h2細胞平衡。藥物能否干預調節T淋巴細胞（C D3+T細胞）及其亞群細胞（C D4+T/C D8+T細胞）的數量、功能及比例，使這種失衡重新回到平衡,無疑是從根本上有效治療本病的關鍵新舉措。因此，本實驗通過建立大鼠P CA模型，觀察不同劑量“膚敏”膏對T h1、T h2細胞分化的前體細胞C D3+T、C D4+T細胞的影響，進而反映“膚敏膏”對皮膚過敏細胞免疫功能紊亂的影響，揭示該中成藥作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 S P F級S D大鼠，體質量200～300g，雌雄兼用，由四川醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：S C X K(川)2012-16。

1.1.2 試劑 卵白蛋白（E gg A l b u m i n）：Si g ma進口分裝，由天津市灝洋生物制品有限責任公司分裝，批號 A-5378。FI T C a n t i-rat C D3，P E a nt i-rat C D4，P E a n t i-rat C D8，R B C裂解液，P B S洗滌液均為美國B i o l e g e n d公司原裝進口。地塞米松：昆明振華制藥廠生產，0.75m g/片，批號120417。

1.1.3 儀器 FAC S Va n ta g e S E型流式細胞儀（美國BD公司生產），S P X-250BZ電子恒溫培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠生產），T GL-20M高速臺式離心機（上海第三儀器廠生產）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠PCA（被動皮膚過敏反應）模型的建立[1]大鼠抗血清制備：雄性大鼠，180～220 g，每側大腿肌肉注射1%卵白蛋白0.5mL，同時腹腔注射5%氫氧化鋁凝膠0.1mL。14天后取血，2000 r p m離心10分鐘，制備大鼠抗卵白蛋白血清，置低溫冰箱保存。注：氫氧化鋁凝膠制備：稱取適量氯化鋁，加少量生理鹽水溶解，用氫氧化鈉溶液調p H至8即可。大鼠同種P CA：除正常組外，其余各組大鼠背部皮內注射1∶2稀釋的抗血清，0.1mL/點，共2點，24小時后，按10mL/kg的給藥容積靜脈注射2%卵白蛋白溶液攻擊。

1.2.2 實驗分組 大鼠60只，雌雄各半，隨機分成6組，每組10只，分別為低、中、高劑量“膚敏”膏組，陽性組（地塞米松）、模型組和正常組。灌胃給藥劑量依次為1.04，2.07，7.24，0.00041g/kg,模型組和正常組均給予同體積生理鹽水。灌胃1次/d，連續5天。除正常組外，各組大鼠于第5天分別背部皮內注射稀釋的抗血清致敏，24小時后靜脈注射2%卵白蛋白溶液進行攻擊，30分鐘后大鼠用3.5%的水合氯醛麻醉，腹主動脈取血 2~3mL，肝素鈉充分抗凝，檢測T淋巴細胞及其亞群。

1.2.3 T淋巴細胞（CD3+T細胞）及其亞群（CD4+T、CD8+T細胞）測定[2]采用免疫熒光流式細胞技術檢測T淋巴細胞及其亞群。1）每只動物分別取2份各100μL的抗凝全血置于2個流式管中，每管中分別加入FI T C a n t i-rat C D3、P E a n t i-rat C D4和FI T C a n t i-rat C D3、P E a n t i-rat C D8，進行熒光標記。2）將上述各管避光、2~8℃孵育30分鐘。3）取出各管分別加入R B C裂解液2 mL，使紅細胞充分裂解至管內液體澄清透亮為止。離心（100 r/m i n），棄上清液。4)各管分別用1.5 mL P B S液洗滌2~3次，離心，棄上清液。5）各管加入200~ 300μL P B S液，充分彈開細胞，上機檢測。6）流式細胞儀檢測條件及參數采用美國BD公司生產的FAC S Va n ta g e S E型流式細胞儀，激發光源為15m W氬離子激光器，激發波長為 488 n m，應用C E LL Q u est進行免疫熒光數據分析。檢測前以f l ow-c h ec k F l u or p h eres(10u m)熒光微球（R E F 6605359 B ec k e n Co u l ter，I n c f u l l erto n，CA 92835）作為標本樣品，調整儀器CV值在2%以內。1.3 統計學方法 用S P SS 19.0軟件進行統計分析，計量資料以(±s)表示，符合正態分布組間采用A N OVA分析，方差齊者組間進行L S D-t檢驗，方差不齊者進行T am h a n e’s T2檢驗，不符合正態分布的組間采用非參數檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

與正常組比較，造模后大鼠外周血C D3+T和C D4+T細胞表達率均值明顯降低，差異具有顯著性意義（P＜0.01）；而C D8+T細胞無統計學意義（P＞0.05）。經給藥后，與模型組比較，“膚敏膏”低、中、高3劑量組C D3+T和C D4+T細胞表達率均值明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；C D8+T細胞無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 對大鼠T淋巴細胞及其亞群的影響%

3 討論

C D3+T細胞可代表所有成熟T細胞。而在成熟T細胞表面可分為C D4+T和C D8+T細胞兩個亞類。即輔助性T細胞（T h）和抑制性T細胞（T s）。C D4+T細胞介導的細胞免疫可引起組織以淋巴細胞（主要是T細胞）和單核吞噬細胞浸潤為主的滲出性炎癥發生。致敏后各種炎癥細胞和活性因子引起血管擴張、管壁通透性增強，形成濕疹樣病變，表現為紅斑、丘疹、水皰等一系列皮膚炎癥反應。同時C D4+T細胞進一步分為T h1和T h2兩細胞亞群，它們合成和分泌大量細胞因子如IL-2、4、6、10，IF N-γ、T N F-β、L T等，進而吸引炎癥細胞趨向局部。所以C D4+T細胞為T h1/T h2細胞分化的前體細胞，C D4+T/C D8+T細胞平衡直接影響后續T h1/T h2細胞平衡[3-4]。故進行C D3+T、C D4+T、C D8+T細胞含量測定以反映“膚敏膏”對皮膚過敏細胞免疫功能紊亂和T h1/T h2細胞分化的前體細胞的影響。

實驗結果表明：造模后大鼠外周血C D3+T和C D4+T細胞表達率均值明顯降低，（P＜0.01）。C D8+T細胞有升高趨勢，但無統計學意義（P＞0.05），C D4+T/C D8+T比值與正常對照組相比明顯降低（P＜0.05），這與鄧丹琪[3]的研究結果一致，反映出模型動物存在細胞免疫功能紊亂。經“膚敏膏”低、中、高3劑量組治療后，大鼠C D3+T和C D4+T細胞表達率均值不同程度升高（P＜0.05）；C D8+T細胞有升高趨勢，但無統計學意義（P＞0.05）。通過實驗研究，我們認為“膚敏膏”的作用機理可能與其調節C D3+T、C D4+T細胞平衡有關，通過對其數量紊亂的糾正作用，從而調節細胞免疫功能以間接的干預T h1/T h2細胞分化及平衡,在過敏反應早期調節細胞免疫平衡以阻斷病變進程。從而阻斷過敏性皮膚病的發生、發展，從根本上改善過敏體質，以達消敏、抗敏作用。

[1] 徐淑云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學[M].北京：人民衛生出版社，2003：1196-1200.

[2] 曾秋妹，潘祥龍.中藥抗炎一號注射液治療急性皮炎濕疹對T細胞亞群影響[J].福建醫藥雜志，2001，23（5）：3-5.

[3] 鄧丹琪.濕疹的皮膚實驗及細胞免疫功能的觀察[J].中國皮膚性病學雜志，1998，11（12）：42-43.

[4] Bel linghausen I,Brand U.Comparsion of al lergen stimulated dendritic f rom atopic and nonatopic donors dissecting their ef fect on autologous nave and memory T helper cel ls of such donors[J].J Al lergy Clin Immunol,2000,105（4）:988-996.

The Influenceof FuM in Ointm enton T Lym phocytesand ItsSubsets of PCA RatModel lym phocyte

LIJingping1,LIQingsheng2,QIYan3
1 Yunnan University of TCM,Kunming 650500,China;2 Kunming Medical University；3 Yunnan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

Objective:To explore themechanism of FuM in ointment fighting against skin allergic reaction by studying itseffectson T lymphotesand itssubsetsof passive cutaneousanaphylaxis(PCA)ratmodel.Methods:PCA ratmodelwas established w ith ovalbumin,expression rates of CD3+T,CD4+T and CD8+T in peripheral blood of PCA ratswere detected by immunofluorescent flow cytometry and the effectsof FuM in ointmenton three kindsof cells.Results:Compared with themodel group,three groups of FuM in ointmentwere higher than themodel group in CD3+T, CD4+T and CD8+T cellular expression rates average values obviously(P＜0.05).Conclusion:Themechanism of FuM in ointmentmightbe related to its function of regulating CD3+T and CD4+T quantity disorder indirectly,therefore,to intervene Th1/Th2 cells differentiation and balance,regulating cellular immunity balance in allergic reaction in order to cease pathologicalprogress.

PCA ratmodel;T lymphotesand its subsets;FuM in ointment

R285.5

A

1004-6852(2015)08-0006-03

2014-10-25

李靜平(1979—)女，博士學位，講師。研究方向：臨床中藥學。