吸入氫氣對膿毒癥大鼠心肌損傷的影響

張聰聰 鞏霞 王濱 朱建昌 陳欣欣 張泉三

嚴重膿毒癥是一種嚴重的全身性炎癥反應，可在短時間內發展為多器官功能障礙綜合征（Multiple organ dysfunction syndrome，MODS），甚至死亡，它是重癥醫學中的難點，其中心肌損傷是膿毒癥最常見的并發癥，嚴重影響著患者的預后。因此，早期有效的預防治療膿毒癥患者的心肌損傷成為治療的重要部分[1-2]。氫氣是一種還原性的惰性氣體，最近研究發現氫氣的還原性在治療急性損傷中心肌缺血再灌注損傷有特殊的作用[3]。但其對膿毒癥心肌損傷的作用不明，本研究探討吸入氫氣對膿毒癥心肌損傷的影響，為臨床上治療膿毒癥心肌損傷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選擇日齡80~90 d雄性SD大鼠48只，體重（220±25）g，購于青島大學醫學院實驗中心，通過隨機數字法分為4組，每組各12只：假手術組（SH組）、膿毒癥組（CLP組）、1%氫氣組（1%H2組），2%氫氣組（2%H2組）。SH組作為假手術組，CLP組為膿毒癥無治療組，1%氫氣組分別在CLP術后1、6 h吸入1%氫氣1 h，2%氫氣組分別在CLP術后1、6 h吸入2%氫氣1 h。

1.2 動物模型制作 參照文獻[4]采用盲腸結扎并穿刺法制作膿毒癥大鼠模型，SH組不結扎穿刺盲腸，其他操作與CLP組相同。所有大鼠腹腔注射濃度20%的烏拉坦（0.5 mL/100 g）麻醉后固定于動物手術臺上，在腹部正中作長約3 cm的切口，探查并游離出盲腸，在距盲腸根部1 cm處用3-0絲線結扎盲腸，結扎過程勿結扎到腸系膜血管及回腸。在盲腸的腸壁的漿膜面上用18號針穿刺3次，相距0.5 cm/針，以輕輕擠壓腸管有糞便從穿刺孔中流出為準，腸管仔細還納回腹腔并關腹。參照文獻[5]的方法，使用M177021氫氣發生器（北京中西遠大公司），通過電解水產生氫氣，氫氣純度約為99.999%。將大鼠放入帶有入氣口和出氣口的密閉箱子，將氫氣和氧氣通過入氣口輸入箱子里，并在出氣口收集殘氣。使用泵吸式JSA8-H2高敏氫氣檢測儀（深圳吉順安科技有限公司）監測出氣口H2的濃度并調節到氫氣到相應的濃度。1%H2組和2%H2組分別在CLP術后1、6 h吸入相應濃度的氫氣1 h，其他組進行相應的操作但不吸入氫氣。

1.3 方法 各組大鼠均在造模成功后24 h處死，處死前用20%的烏拉坦麻醉，通過腹主動脈采集血液標本，離心后取上清液，用酶聯免疫吸附（ELISE）法測定血清中cTnI和BNP的濃度，操作嚴格參考試劑盒說明書（試劑盒購買于美國R&D公司）。處死大鼠后立即分離左心室，用冷生理鹽水將左心室的血跡沖洗干凈，取心尖處的少量心肌，用甲醛固定后進行HE染色，參照文獻[6]在光鏡下觀察心肌組織計算病理積分。在光鏡下隨機觀察10個視野，觀察并計算每個視野中心肌組織的炎癥細胞的浸潤、壞死及水腫面積與整個視野面積的比例；正常心肌計0分，<1/4計1分，1/4~1/2計2分，1/2~3/4計3分，>3/4計4分，最后計算10個視野評分算平均值。剩余的心肌組織取約1 g加入4 ℃預冷的生理鹽水中，制作組織勻漿并保存于-70 ℃中。用ELISE法測定ET-1、TNF-α、IL-6的蛋白表達水平，操作嚴格按照試劑盒說明書（試劑盒購買于美國R&D公司）。采用硝酸還原酶法測定大鼠心肌組織中NO的含量（試劑盒購買于南京建成科技有限公司），操作嚴格按照試劑盒說明書。

1.4 統計學處理 使用SPSS 17.0軟件進行統計分析，計量資料采用（s）表示，組內比較采用重復測量設計的方差分析，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清cTnI、BNP和心肌病理評分的比較 與SH組相比，其他各組大鼠血清cTnI、BNP表達水平及心肌病理評分均明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；與CLP組相比，l%H2組和2%H2組的cTnI、BNP的表達水平及心肌病理評分明顯下降，差異均有統計學意義（P<0.05）；而l%H2組和2%H2組的血清cTnI、BNP和心肌病理評分比較差異均無統計學意義（P>0.05），見表 1。

表1 各組血清cTnI、BNP和心肌病理評分的比較（s）

表1 各組血清cTnI、BNP和心肌病理評分的比較（s）

*與SH組比較，P<0.05；△與CLP組比較，P<0.05

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2.2 各組大鼠心肌ET-1和NO的比較 與SH組相比，其他各組大鼠心肌ET-1表達水平明顯升高，而NO表達水平明顯降低，差異均有統計學意義（P<0.05）；與CLP組相比，1%H2組和2%H2組的大鼠心肌ET-1表達水平明顯下降，而NO表達水平升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；但1%H2組和2%H2組的組間比較差異均無統計學意義（P>0.05），見表2。

表2 各組大鼠心肌ET-1和NO的比較（s）

表2 各組大鼠心肌ET-1和NO的比較（s）

*與SH組比較，P<0.05；△與CLP組比較，P<0.05

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2.3 各組心肌組織中TNF-α和IL-6的比較 與SH組相比，其他各組大鼠血清TNF-α和IL-6表達水平均明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；與CLP組比較，各組的TNF-α和IL-6的表達水平均明顯下降，差異均有統計學意義（P<0.05）；而1%H2組和2%H2組比較差異均無統計學意義（P>0.05），見表3。

表3 各組心肌組織中TNF-α和IL-6的比較（s） pg/mL

表3 各組心肌組織中TNF-α和IL-6的比較（s） pg/mL

*與SH組比較，P<0.05；△與CLP組比較，P<0.05

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3 討論

膿毒癥是由嚴重感染、創傷引起的全身炎癥性反應，是ICU中非心臟患者的常見死亡原因之一。在膿毒癥早期即常伴有不同程度的心肌損傷，表現為心力衰竭、低血壓、心律失常等，可導致其他器官的損傷。因此，膿毒癥心肌損傷的早期診斷與治療變的十分重要[7]。本研究采用CLP法制備的大鼠膿毒癥心肌損傷模型，它的機制是通過大鼠盲腸的結扎和穿孔，使腸內容物細菌進入污染腹腔，造成大鼠的彌漫性腹膜炎，誘發全身性破壞性炎癥反應的發生，與脂多糖（LPS）誘導的膿毒癥相比具有更好的臨床相關性，在動物實驗中廣泛使用[4]。

氫氣是一種呈中性的小分子，具有良好的膜通透性，能順利進入細胞內發揮消除羥自由基。氫氣具有很弱的還原性，它只能和活性強的羥自由基結合反應，但不與具有信號作用的氧自由基反應。研究表明，氫氣在器官的缺血再灌注損傷中發揮著重要作用，其具有抗氧化、抗凋亡和抗炎癥反應等器官保護作用[8]。但氫氣在體內的半衰期短，只有較長時間吸入氫氣才可以很好發揮它的抗氧化作用，本研究在CLP術后1、6 h持續吸入相應濃度的氫氣1 h[9]。

cTnI是檢測心肌損傷的重要指標，具有較好的敏感性和特異性，正常人cTnI含量很低，在心肌損傷時cTnI顯著升高，能在一定程度上評價預后[10]。BNP是主要是由心室分泌的，具有預測膿毒癥患者的心肌損傷的價值，并具有很好的靈敏性，一般伴隨膿毒癥的康復，BNP逐步下降，心肌功能障礙得到改善[11]。本研究采用cTnI和BNP評價大鼠心肌損傷的程度，研究結果顯示：與SH組相比，其他各組大鼠血清cTnI、BNP表達水平均明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；與CLP組相比，1%H2組和2%H2組的cTnI、BNP的表達水平均明顯下降，差異均有統計學意義（P<0.05），表明膿毒癥大鼠出現明顯心肌損傷，而吸入氫氣可以減輕膿毒癥大鼠心肌損傷的程度。

ET-1是一種由血管內皮細胞釋放的血管活性多肽類小分子物質，不僅具有強烈的收縮動靜脈血管的作用，還在心血管的內分泌、胃腸道、腎臟等方面發揮一定作用，其中，ET-1能強烈的收縮冠狀動脈血管并減低心率[12-13]。NO是內皮細胞產生的舒張血管的物質，一方面它具有維持血管張力，調節血壓，增加冠狀動脈血流等作用，另外，NO還可以清除自由基，降低機體脂質過氧化的水平[14]。既往有研究表明，在心肌缺血再灌注時，心肌損傷與血漿的NO含量下降有關[15]。在一般情況下，NO和ET-1保持相對平衡，維持血管的舒縮狀態，在心肌發生缺血缺氧時，內皮細胞釋放NO和ET-1比例失調，可引起冠脈血管收縮，血流量下降，進一步加重心肌的損傷[16]。研究結果顯示：CLP組大鼠心肌ET-1表達水平明顯升高，而NO表達水平明顯降低，與其他組比較差異均有統計學意義（P<0.05）；吸入H2組的大鼠心肌ET-1表達水平明顯下降，而NO表達水平升高，與其他組比較差異均有統計學意義（P<0.05），表明膿毒癥大鼠出現心肌血液循環障礙引起心肌損傷，提示吸入氫氣可能通過抑制心肌微循環障礙來減輕大鼠的心肌損傷。

在膿毒癥時機體可以產生大量的炎性因子，可通過多種途徑造成心肌的損傷，TNF-α和IL-6是機體炎癥反應中重要的早期應答因子[17-19]。TNF-α主要由激活的巨噬細胞、內皮細胞、中性粒細胞、內皮細胞等分泌的，具有啟動和觸發炎癥反應的作用，可誘導其他炎癥介質和黏附分子以及生長因子的表達，還具有增加血管內皮細胞通透性的作用[20]。IL-6是由TNF-α激活內皮細胞、巨噬細胞分泌的，具有趨化作用，可導致溶菌酶釋放和氧自由基產生，加重臟器的損傷[21]。研究表明，TNF-α和IL-6被認為是在膿毒癥的發生發展中最主要的炎性介質[22]。既往研究發現，在膿毒癥患者血清中TNF-α和IL-6的生成明顯增加，并可以抑制心肌收縮力[23]。本次研究結果顯示：CLP組大鼠血清TNF-α和IL-6表達水平均明顯升高，通過吸入H2的TNF-α和IL-6的表達水平均明顯下降，差異均有統計學意義（P<0.05），提示吸入氫氣可能通過抑制炎癥反應來減輕膿毒癥大鼠心肌損傷。

綜上所述，吸入氫氣可以改善膿毒癥大鼠的心肌損傷，其可能機制與改善心肌組織微循環和抑制炎癥反應有關。

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