依達拉奉預處理有效保護大鼠脊髓神經元氧化應激損傷

王正樂，劉培釗，2 (.中國人民解放軍第7872 部隊衛生隊，河南 信陽 46400;2.第二軍醫大學研究生管理大隊，上海200433)

脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)及其導致的截癱是降主動脈和胸、腹主動脈手術后的嚴重并發癥，發生率高達3.8%～16.7%。極大影響了手術效果，并給患者造成巨大的心理和經濟負擔［1］。目前，仍缺乏積極有效的預防措施。

脊髓損傷包括原發性損傷和繼發性損傷兩個過程。原發性損傷是由各種因素導致的脊髓組織的直接損傷，具有即刻性和不可逆性特點。繼發性損傷則是由原發損傷導致的一系列生物化學反應，包括水腫、缺血再灌注損傷、炎性反應、興奮性毒性以及氧化應激損傷等［2-3］。研究表明，自由基大量生成導致的氧化應激損傷是脊髓繼發性損傷的重要機制［2］。針對這一機制，利用抗氧化劑防治脊髓損傷的研究和應用正在不斷深入開展。抗氧化劑，如番茄紅素、17-β 雌二醇、氫氣等均已被證明能有效防治脊髓損傷［4-6］。依達拉奉(Edaravone，Ed)是安替吡啉的代謝產物，是一種非常強的自由基清除劑，目前已廣泛應用于臨床上中風患者的治療。研究表明依達拉奉預處理可通過有效清除氧自由基，抑制脂質過氧化，延遲神經細胞凋亡，減輕腦缺血以及腦缺血引起的腦水腫和組織損傷［7］。隨著研究的不斷深入，Ed 預處理對腎臟、肝臟、腸、視網膜以及心臟等器官缺血再灌注損傷的保護效應也得到了廣泛的證明［8］。但是Ed 預處理能否對脊髓損傷起到保護作用，仍不清楚，也未見報道。本研究以離體培養大鼠脊髓神經元為研究對象，觀察Ed 預處理對大鼠脊髓神經元氧化應激損傷的保護效應，為脊髓損傷的防治提供新的方法。

1 資料與方法

1.1 動物及試劑:雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，孕14 d，購于第二軍醫大學實驗動物中心。Neurobasal 培養基和B27 購于Gibco 公司。β-tubulin Ⅲ抗體購于Sigma 公司。蛋白提取試劑盒、BCA 法蛋白定量試劑盒、總超氧化合物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒以及谷胱甘肽氧化酶(GSH-Px)檢測試劑盒均購于江蘇碧云天生物技術研究所，CCK-8 檢測試劑盒購于日本同仁公司，乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購于南京建成公司。Ed 購于福建天泉藥業股份有限公司。番茄紅素(Lycopene，LP)購于新疆瑞德萊福生物科技有限公司。

1.2 脊髓神經元培養:10%水合氯醛麻醉SD 孕鼠，無菌條件下取出胎鼠，解剖鏡下分離出脊髓，仔細分離軟脊膜和血管。用D1-SGH 解剖液(D1 為無鈣、鎂離子的Pucks 液，SGH 為蔗糖、葡萄糖和HEPES 的緩沖液)清洗分離的脊髓3 次，虹膜剪將脊髓剪成約1 mm3的組織塊。然后用0.05%胰蛋白酶于37℃培養箱中消化20 min。用含20%胎牛血清的DMEM 終止消化1 min。巴斯德滴管吹打15 次制成單細胞懸液，靜置10 min后收集中層細胞懸液，以1×106/ml 的密度均勻接種于細胞培養板中培養，4 h 后全量換含2%B27 的Neurobasal 培養基，24 h 后加入阿糖胞苷(5 μmol/L)抑制膠質細胞生長(作用24 h)，以后每3 天進行半量換液。

1.3 脊髓神經元鑒定:取培養7 d 的脊髓神經元進行免疫組織化學染色。棄培養液，PBS 漂洗2 次后加入4%多聚甲醛，室溫固定30 min，PBS 漂洗5 min×4，加β-tubulin Ⅲ抗體每蓋片50 μl，37℃濕盒孵育1 h 后4℃冰箱過夜，PBS 漂洗5 min×3次，HRP 標記山羊抗兔IgG 37℃孵育1.5 h，PBS 漂洗5 min×3次，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚染細胞核5 min，漂洗封片后熒光顯微鏡觀察、照相。

1.4 實驗分組:實驗一共分為7 組(n=3)正常對照組(Con)、H2O2損傷組、GOX 損傷組、Ed+H2O2損傷組、Ed+GOX 損傷組、LP+H2O2損傷組、LP+GOX 損傷組。Ed 和LP 均在損傷前30 min 加入，Ed 終濃度為25、50、100 μM，LP 終濃度為5 μM［9］。

1.5 氧化損傷模型:實驗中采用了H2O2損傷模型和GOX 損傷 模 型:H2O2 損 傷 模 型(200 μl，4 h)，GOX 損 傷 模 型(20 mU/ml，2 h)

1.6 細胞損傷檢測

1.6.1 細胞活性檢測:脊髓神經元培養在96 孔板中，損傷結束后，PBS 漂洗2 遍，全量換含有CCK-8 檢測試劑的Neurobasal 培養基(CCK-8 檢測試劑和培養基的比例為1∶10)，在細胞培養箱中培養3 h 后檢測450 nm 處吸光值。

1.6.2 LDH 含量檢測:脊髓神經元培養在6 孔板中，損傷結束后收集培養液，然后按照LDH 檢測試劑盒說明書，測定培養基中LDH 含量。

1.6.3 MDA 含量檢測:脊髓神經元培養在6 孔板中，損傷結束后棄培養基，用PBS 漂洗兩遍，然后用細胞裂解液在冰上裂解10 min，收集細胞裂解液后按照MDA 檢測試劑盒說明書，測定細胞裂解液中MDA 含量。

1.7 SOD 和GSH-Px 活性檢測:脊髓神經元培養在6 孔板中，將各組細胞裂解后按說明書測定總SOD 和GSH-Px 活性。

2 結果

2.1 脊髓神經元培養和鑒定:A 為脊髓神經元培養7 d 時光鏡下的照片(×200)，B 為免疫組化鑒定結果。細胞免疫化學染色顯示神經細胞表達特異性抗原(β-tubulin Ⅲ)，神經細胞及其突起染色呈棕褐色，細胞核被4'，6-二脒基-2-苯基吲哚染染色呈藍色。在光鏡下隨機視野中計數陽性染色細胞顯示培養體系中神經元細胞比例在90%以上。見圖1。

圖1 大鼠脊髓神經元培養和鑒定

2.2 不同濃度Ed 對脊髓神經元活性的影響:25、50、100 μM的Ed 對大鼠脊髓神經元活性并無明顯影響。見圖2。

圖2 不同濃度依達拉奉對大鼠脊髓神經元活性的影響

2.3 Ed 預處理減輕大鼠脊髓神經元氧化應激損傷:H2O2(200 μM，4 h)和GOX(20 mU/ml，2 h)均能明顯誘導脊髓神經元氧化應激損傷，包括降低脊髓神經元活性、升高神經元MDA 含量以及升高培養液中LDH 含量。提前30 min 給予不同濃度Ed(25、50、100 μM)和LP 預處理能明顯逆轉H2O2和GOX 誘導的脊髓神經元氧化應激損傷。P ＜0.01 vs.Con 組，#p ＜0.05 vs.H2O2/GOX 組，##和＆P ＜ 0.01 vs.H2O2/GOX 組，$P ＜0.05 vs.LP+H2O2/GOX 組。提前30 min Ed 預處理可以明顯減輕H2O2和GOX 對脊髓神經元的損傷。見圖3。

圖3 依達拉奉預處理對大鼠脊髓神經元氧化應激損傷的保護效應

圖4 依達拉奉預處理對大鼠脊髓神經元總SOD 和GSH-Px 活性的影響

2.4 Ed 預處理上調大鼠脊髓神經元SOD 和GSH-Px 活性:H2O2和GOX 均能明顯降低脊髓神經元總SOD 和GSH-Px 活性。提前30 min 給予Ed 和LP 預處理均能顯著升高脊髓神經元總SOD 和GSH-Px 活性。*P ＜0.01 vs.Con 組，#和＆P ＜0.01 vs.H2O2/GOX 組，$P ＜0.05 vs.LP+H2O2/GOX 組。見圖4。

3 討論

氧化應激是脊髓損傷的重要機制之一，本研究發現Ed 預處理可以明顯減輕H2O2和GOX 誘導的脊髓神經元氧化應激損傷，顯著上調脊髓神經元內總SOD 和GSH-Px 的活性。

脊髓是中樞神經系統的重要組成部分。脂質含量比較高，氧化應激損傷在脊髓損傷中起著非常重要的作用。此外，由于神經細胞的修復能力差，脊髓損傷后，救治困難，常遺留嚴重的后遺癥［1］。

H2O2是機體內一種重要的活性氧，外源性H2O2極易通過細胞膜，進入細胞后的H2O2可以與細胞內的過度金屬發生Fenton 反應，形成高活性的自由基如單態氧、羥自由基等，進一步造成細胞損傷［10］。在本實驗中，采用直接給予外源性H2O2和給予GOX 間接增加細胞內H2O2含量方法來建立神經元氧化應激損傷模型。在機體內GOX 與過氧化氫酶組成一個氧化還原酶系統，能夠氧化β-D-葡萄糖生成H2O2和D-葡萄糖酸內酯，在這個過程中葡萄糖氧化酶的特點是能夠消耗氧氣，催化葡萄糖氧化，生成濃度較穩定的H2O2［11］。實驗結果表明直接給予外源性H2O2 和給予GOX 均能明顯降低神經元活性、顯著增加神經元MDA 含量和培養液中LDH 含量，提示在本實驗中這兩種方法均能成功建立神經元氧化應激損傷模型。

SOD 和GSH-Px 是細胞內抗氧化物酶系統的重要組成部分。SOD 能催化超氧化物陰離子生成H2O2。GSH-Px 可以分解H2O2和過氧化物，清除細胞內脂質和有機過氧化反應的產物，阻斷脂質過氧化連鎖反應，達到保護細胞膜機構和功能完整的作用［12］。MDA 和LDH 是較為常用的細胞損傷評價指標。MDA 是機體內脂質過氧化產物，可以反映機體內脂質過氧化的嚴重程度。LDH 在細胞損傷后釋放到周圍環境中，能進一步證實細胞損傷。SOD、GSH-Px、MDA 和LDH 測定的聯合應用既反映了機體清除氧自由基的能力，又間接反映了機體細胞受自由基攻擊后損傷的嚴重程度。

Ed 是一種極強的自由基清除劑，能有效清除細胞內自由基，保護細胞氧化應激損傷。在本研究中選取了25、50、100 μM三個不同的濃度，研究證實隨著Ed 劑量的增加，Ed 預處理對脊髓神經元氧化應激損傷的保護效應逐漸增強即存在劑量效應。但是由于本實驗的主要目的是探討Ed 預處理是否對脊髓損傷具有保護效應，所以繼續增加Ed 劑量能否更有效的保護脊髓神經元氧化應激損傷并為進一步探索。LP 是一種開鏈式的不飽和類胡蘿卜素，具有較強的抗氧化和清除自由基的能力，并且已被證明能有效保護神經細胞氧化應激損傷［13］。在本實驗中使用LP 的目的是作為陽性對照，進一步說明LP 對脊髓神經元氧化應激損傷的保護作用［14］。實驗結果表明LP 50 μM對脊髓神經元氧化應激損傷的保護作用與LP 的保護作用沒有明顯差異，但是依達拉奉100 μM 對脊髓神經元氧化應激損傷的保護作用則明顯強于LP。

本研究以離體培養脊髓神經元為研究對象發現Ed 預處理可通過上調細胞內抗氧化物酶活性保護脊髓神經元氧化應激損傷［15］。Ed 預處理作為一種簡易方便、安全有效的方法在臨床上防治脊髓損傷可能將有較高的應用價值，但對其作用機制還有待進一步深入研究。

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