Rho 激酶抑制劑用于腦損傷治療的初步實驗研究

彭智濤，陳建良 (廣東省深圳市第四人民醫院神經外科，廣東 深圳 518000)

心腦血管疾病的發病率逐漸上升，嚴重威脅人類健康及生命安全。多項研究顯示，Rho/Rock 激酶信號通路在腦梗死等神經系統疾病的病理機制中扮演著重要角色，作為信號轉換器或分子開關，參與調控細胞形態維持、細胞黏附與遷移、細胞增殖與凋亡、基因轉錄、平滑肌收縮等多種生物學行為，介導了多種平滑肌與非平滑肌功能異常相關疾病的發生［1］。近年來，Rho激酶抑制劑因其良好的神經保護作用逐漸成為治療心腦血管疾病的重要藥物。本研究通過分離培養大鼠神經干細胞，并通過軟瓊脂實驗、免疫熒光檢測、Western blotting 檢測等觀察Rho激酶抑制劑Y27632 對神經干細胞增殖分化的影響，以期為神經干細胞移植治療腦損傷中提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 神經干細胞的分離與培養:選取孕12 ～14 d 的SD 大鼠，斷頭處死并浸于75%乙醇內消毒，無菌條件下剪開腹部皮膚及筋膜，分離子宮，置于D-Hanks 液內清洗后分離胎鼠，取其頭部并在解剖顯微鏡下暴露其大腦，獲取海馬組織，將其制作成1 mm3組織塊，加入DMEM/F12 1∶1培養液，反復吹打，制作單細胞懸液，臺盼藍染色計數，調整細胞濃度為1×106個/ml，接種于12 孔培養板內，37℃5%CO2培養箱培養，隔日半量換液。

1.2 神經干細胞的鑒定:通過免疫熒光檢測神經干細胞特異性蛋白Nestin、CD133 進行神經干細胞鑒定，具體操作如下:取100 μl 細胞懸液滴于經預處理的載玻片上，50℃溫浴10 min，確保細胞緊貼于載玻片上;滴加4%多聚甲醛1 ml 固定20 min，PBS 溶液沖洗;滴加0.4%Triton-X100 消化30 min，PBS 溶液沖洗;3%BSA 封閉，37℃孵育30 min;除去封閉液，加入稀釋200 倍后的Nestin、CD133 一抗，4℃孵育過夜，TBST 沖洗;滴加熒光二抗，37℃避光孵育30 min，TBST 沖洗;DAPI 染色;激光共聚焦顯微鏡下觀察染色結果。

1.3 Y27632 對神經干細胞增殖分化能力的影響

1.3.1 實驗分組:本實驗共設置對照組、LPA 組、Y27632 組三個組別，每組設置三組重復，分別采用DMEM/F12、DMEM/F12+LPA(終濃度200 ng/ml)、DMEM/F12 + LPA(終濃度200 ng/ml) +Y27632(終濃度200 ng/ml)進行細胞培養。

1.3.2 軟瓊脂檢測:軟瓊脂檢測采用上海美科美生物科技有限公司生產的軟瓊脂克隆試劑盒，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行，37℃、5%CO2培養2 周后，觀察軟瓊脂克隆形成情況。

1.3.3 熒光定量檢測Ki67 和GFAP 基因表達水平:收集對照組、LPA 組、Y27632 組的細胞，經總RNA 提取、逆轉錄，獲取cDNA，-20℃保存備用;設計并合成Ki67、GFAP、GAPDH 基因的引物，以GADPH 為內參基因，相對定量分析Ki67、GFAP 的mRNA 表達水平。

1.3.4 Western blotting 檢測Ki67 和GFAP 基因的相對表達量:收集對照組、LPA 組、Y27632 組的細胞，冷PBS 溶液反復清洗，加入200 μl 的細胞裂解液重懸細胞并反復吹打，冰上放置10 min，確保細胞充分裂解;4℃，12 000 rpm 離心15 min，取上清，采用2-D 定量試劑盒進行蛋白質定量，調整各組總蛋白質濃度為5 μg/μl，制備上樣液，后經SDS-PAGE 電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色等操作，采用冷凍CCD 曝光顯影，并采用Image Quant TL-1D Analysis Tool 對免疫印跡結果進行定量分析。

1.4 統計學分析:數據處理采用SPSS19.0 統計學軟件進行，計量資料采用均數±標準差表示，組間比較行t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經干細胞鑒定結果:采用免疫熒光檢測Nestin、CD133蛋白的表達情況如圖1 所示，分離培養的神經干細胞均呈NSC、Nestin 染色陽性。

圖1 免疫熒光鑒定NSC(400×)

2.2 軟瓊脂檢測Y27632 對神經干細胞增殖能力的影響:經過2 周培養，如表1 所示，LPA 組的單克隆細胞個數及單克隆形成率較對照組及Y27632 組顯著升高(P ＜0.05)，表明LPA 處理能夠促進NSCs 細胞的增殖，而Y27632 組的單克隆細胞個數及單克隆形成率與對照組相比差異無統計學意義(P ＞0.05)，表明Y27632 對NSCs 單克隆無促進作用。

表1 NSC 單克隆細胞的個數及形成率

表1 NSC 單克隆細胞的個數及形成率

NSC 細胞 對照組 LPA 組 Y27632組單克隆的個數198±36.23 305±63.71 186±32.90單克隆形成率(%)19.8±3.62 30.5±6.37 18.6±3.29

2.3 熒光定量檢測GFAP 和ki67 基因的表達量:不同組的GFAP 和ki67 基因的表達量如表2 所示，與對照組相比，LPA 組GFAP 基因表達量無顯著性變化(P ＞0.05)，而Ki67 基因表達量顯著性升高(P ＜0.01);而Y27632 組ki67 基因表達量無顯著變化(P ＞0.05)，而GFAP 基因表達量顯著性升高(P ＜0.05)。

表2 熒光定量檢測GFAP 和ki67 基因的表達量

表2 熒光定量檢測GFAP 和ki67 基因的表達量

注:與對照組比較，①P ＜0.05;②P ＜0.01

項目 對照組 LPA 組 Y27632組GFAP 表達量 1.00±0.47 1.05±0.53 5.03±0.62①ki67 表達量 1.00±0.62 2.97±0.74②1.14±0.57

2.4 Western blot 檢測GFAP、ki67 蛋白質表達:以GAPDH 為內參，不同組細胞中GFAP、ki67 蛋白的表達量如圖2、表3 所示，與對照組相比，LPA 組ki67 的表達量顯著升高(P ＜0.05)，GFAP 的表達量無明顯差異(P ＞0.05);Y27632 組細胞GFAP表達量顯著升高(P ＜0.05)，而ki67 有所升高但差異無統計學意義(P ＞0.05)。

表3 Western blot 檢測GFAP、Ki67 蛋白質表達水平

表3 Western blot 檢測GFAP、Ki67 蛋白質表達水平

注:與對照組比較，①P ＜0.05;②P ＜0.01

項目 對照組 LPA 組 Y27632組GFAP 蛋白質表達水平 1.00±0.71 1.03±0.65 2.47±0.56①ki67 蛋白質表達水平 1.00±0.59 2.14±0.73②1.57±0.61

圖2 Western blotting 檢測細胞中GFAP、ki67 蛋白質表達量

3 討論

神經干細胞因具有自我更新、多分化潛能、遷移功能、良好的組織相容性、低免疫源性和可長期存活等特點，可作為細胞移植的供體來源，用于神經系統病變(如帕金森氏病、亨廷頓病等)的治療中，但目前對于其定向誘導分化機制仍不明確。目前研究顯示，Rho/Rock 激酶信號通路在缺血性腦血管病的危險因素、發病機制和病理生理中發揮了重要作用［2］。

溶血磷脂酸(LPA)是一類重要的細胞外信號遞質和細胞內第二信使，具有激活Rho/Rock 激酶信號通路的作用［3］。而Y27632 作為Rho 激酶抑制劑，可與競爭性的抑制ATP 與RockⅡ的結合，抑制其活化，從而促進SCI 后軸突再生與生長［4］。本研究分別采用LPA、Y27632 處理體外培養的神經干細胞發現，LPA 組單克隆的形成率明顯高于Y27632 組和對照組，而加入Y27632 單克隆形成率明顯減少，表明Y27632 促進了NSCs 分化為神經膠質細胞，從而使其形成單克隆的能力減弱;采用免疫熒光及Western bloting 檢測分析發現，LPA 組GFAP 基因表達量無顯著性變化(P ＞0.05)，而Ki67 基因表達量顯著性升高(P ＜0.01);而Y27632 組ki67 表達量無顯著變化(P ＞0.05)，而GFAP 表達量顯著性升高(P ＜0.01)。GFAP 作為星形細胞中間絲的結構蛋白，是成熟的星形膠質細胞的標志，其表達量的升高，表明Y27632 有效地促進神經干細胞的分化［5-6］;此外，Ki67 作為增殖細胞相關的核蛋白，其表達量升高與細胞增殖相關，而Y27632 組細胞其Ki67 的表達量及蛋白質水平均未顯著變化［7-8］。針對GFAP、Ki67 基因表達的分析進一步證實Y27632 可以促進神經干細胞向神經膠質細胞方向分化。

綜上所述，Rho 激酶抑制劑Y27632 能夠顯著提高體外培養神經干細胞的GFAP 表達水平，促進神經干細胞的分化，對于損傷神經細胞的修復具有重要作用。

［1］ 皇甫蓓蓓，仝兆峰，曹秉振.Rho 激酶信號通路與中樞神經系統炎性脫髓鞘病［J］.醫學綜述，2013，19(4):615.

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