常用流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的比較

尚雪穎

常用流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的比較

尚雪穎

目的 通過(guò)對(duì)四種常用流感病毒檢測(cè)方法的比較, 確定適用于常規(guī)監(jiān)測(cè)及疫情暴發(fā)時(shí)的檢測(cè)方法。方法 用四種方法對(duì)隨機(jī)抽取的50份樣品進(jìn)行檢測(cè), 對(duì)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果 膠體金法雖簡(jiǎn)單快速, 但漏檢率較高(20.00%)；RT-PCR法靈敏快捷, 準(zhǔn)確度高(34.00%)；細(xì)胞培養(yǎng)法費(fèi)用適中,檢出率較高(14.00%)；雞胚培養(yǎng)法檢出率最低(2.00%)。結(jié)論 膠體金法適合疫情現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè), RT-PCR法適合實(shí)驗(yàn)室內(nèi)快速檢測(cè), 組織培養(yǎng)法適合常規(guī)監(jiān)測(cè), 雞胚培養(yǎng)法適合流感疫苗生產(chǎn)。

組織培養(yǎng)；雞胚培養(yǎng)；病毒分離；RT-PCR；流感病毒

現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室對(duì)流感病毒的檢測(cè)手段有很多種, 在本科室常用的方法有膠體金法、細(xì)胞培養(yǎng)法、雞胚培養(yǎng)法、RTPCR法四種。為實(shí)際工作中找到最適合的檢測(cè)方法, 更及時(shí)準(zhǔn)確的提供檢測(cè)結(jié)果, 對(duì)實(shí)驗(yàn)室常用的四種流感病毒檢測(cè)方法進(jìn)行比較。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 檢測(cè)樣品 2014年1～4月份本院對(duì)就診的流感樣病例(發(fā)熱, 體溫≥38℃, 伴咳嗽或咽痛之一者, 未服用過(guò)抗病毒藥物［1］)采集的鼻咽拭子, 隨機(jī)抽取50份。流感病毒采樣管由北京友康恒業(yè)科技有限公司購(gòu)買(mǎi)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膠體金法 美國(guó)QUIDEL公司, QuickVue Influenza A+B Test, 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)法 MDCK細(xì)胞由遼寧省疾病預(yù)防控制中心提供。樣品前處理：將采樣管漩渦震蕩10 s, 反復(fù)擠壓拭子頭后棄去拭子, 加入青霉素、鏈霉素、制霉菌素, 4℃靜置2 h。細(xì)胞傳代及病毒接種按照郭元吉等所著的《流行性感冒病毒及其實(shí)驗(yàn)技術(shù)》操作［2］。樣品接種MDCK細(xì)胞培養(yǎng)出的第一代病毒培養(yǎng)液用1%豚鼠血紅血球進(jìn)行微量血凝實(shí)驗(yàn)(haemagglutination assay, HA), HA≥1：8的第一代病毒培養(yǎng)液用血凝抑制法(hemagglutination inhibition, HI)進(jìn)行流感病毒分型鑒定(鑒定試劑盒由國(guó)家流感中心提供)。HA＜1：8的第一代病毒培養(yǎng)液再次接種MDCK細(xì)胞增毒, 增毒后HA≥1：8的第二代病毒培養(yǎng)液用HI法進(jìn)行流感病毒分型鑒定, HA＜1：8的第二代病毒培養(yǎng)液用RT-PCR法進(jìn)行流感病毒分型鑒定。第一代病毒培養(yǎng)液HA為陰性的再次接種MDCK細(xì)胞, 盲傳一代后仍為陰性的報(bào)告未檢出流感病毒。

1.2.3 雞胚培養(yǎng)法 9～11日齡無(wú)特定病原菌(specific pathogen free, SPF)雞胚蛋由北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購(gòu)買(mǎi)。雙腔接種法按照郭元吉等所著的《流行性感冒病毒及其實(shí)驗(yàn)技術(shù)》操作［2］。樣品前處理、增毒、盲傳、鑒定方法同組織培養(yǎng)法。

1.2.4 RT-PCR法 病毒RNA提取用Neasy Mini Kit, 熒光擴(kuò)增用上海之江生物科技有限公司的甲型流感病毒核酸測(cè)定試劑盒、乙型流感病毒核酸測(cè)定試劑盒、甲型流感病毒H1亞型及H3亞型核酸聯(lián)合測(cè)定試劑盒、新型甲型流感病毒(H1N1)核酸測(cè)定試劑盒, 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2 結(jié)果

用四種方法分別對(duì)50份鼻咽拭子進(jìn)行檢測(cè), 因檢測(cè)所用的鼻咽拭子是-70℃冷凍保存過(guò)的, 且拭子上病毒經(jīng)過(guò)保存液稀釋, 所以膠體金法檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性偏低, 并且本次檢測(cè)使用的膠體金試劑盒只能檢測(cè)季節(jié)性人流感A(H1N1亞型和H3N2亞型)以及流感B, 對(duì)新H1N1型流感病毒檢測(cè)能力還不確定。組織培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果顯示第一代HA為陽(yáng)性的7個(gè)樣品中5個(gè)病毒培養(yǎng)液 HA≥1∶32, 2個(gè)HA＜1∶8的病毒培養(yǎng)液經(jīng)增毒后HA≥1∶16。雞胚培養(yǎng)法只檢測(cè)出1個(gè)HA為陽(yáng)性的樣品, 且增毒后仍然HA＜1∶8, 用RT-PCR法鑒定出亞型。組織培養(yǎng)法和雞胚培養(yǎng)法檢測(cè)HA為陰性的樣品經(jīng)盲傳后HA仍為陰性。RT-PCR法檢測(cè)為陰性的樣品其他方法檢測(cè)也都為陰性, 其他方法檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品RT-PCR法無(wú)漏檢, 說(shuō)明此法準(zhǔn)確率最高。采用不同檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的同一份樣品, 鑒定結(jié)果均為同型流感病毒。結(jié)果顯示RT-PCR法檢出率最高, 雞胚培養(yǎng)法檢出率最低。見(jiàn)表1。

表1 四種檢測(cè)方法50例樣本檢驗(yàn)結(jié)果比較(n, %)

3 討論

四種檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)：①膠體金法。優(yōu)點(diǎn)：操作方法簡(jiǎn)單, 耗時(shí)短(≤20 min)；不需儀器設(shè)備, 方便攜帶, 適合有疫情爆發(fā)時(shí)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)；平均每份樣品費(fèi)用低；缺點(diǎn)：漏檢率高, 且只能鑒定出流感病毒的A、B型, 不能進(jìn)行亞型鑒定。②細(xì)胞培養(yǎng)法。優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞可大量繁殖, 受外界影響小, 經(jīng)濟(jì)方便；分離到的病毒抗原性和基因特性比雞胚分離到的更接近原始采集到的樣本［2］。缺點(diǎn)：病毒不能長(zhǎng)期保存, 病毒培養(yǎng)液隨保存時(shí)間延長(zhǎng)滴度下降；傳代細(xì)胞含致癌因子, 不能用于疫苗生產(chǎn)；隨著細(xì)胞傳代增加, 對(duì)病毒敏感性下降［2］；對(duì)實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)水平要求較高；實(shí)驗(yàn)用試劑耗材費(fèi)用較高；實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng), 一般需3～14 d出具結(jié)果。③雞胚培養(yǎng)法。優(yōu)點(diǎn)：雞胚蛋來(lái)源充足, 對(duì)正粘病毒敏感, 通常是無(wú)菌的, 實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單；對(duì)病毒不產(chǎn)生抗體, 利于病毒復(fù)制［2］。缺點(diǎn)：無(wú)特異性的感染指征；陽(yáng)性檢出率低, 漏檢率太高；實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng), 總費(fèi)用高, 經(jīng)常需要連續(xù)傳代以提高HA滴度, 費(fèi)時(shí)費(fèi)力［3］。④RT-PCR法。優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng), 靈敏度高,病毒含量很低的樣品也能檢出；實(shí)驗(yàn)耗時(shí)短(4 h內(nèi)能出具初步鑒定結(jié)果)；可對(duì)HA＜1：8或HI結(jié)果不明確的病毒培養(yǎng)液進(jìn)行鑒定。

綜上所述, 在有流感疫情爆發(fā), 需要進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)時(shí),適合使用膠體金法；需要快速出具準(zhǔn)確診斷結(jié)果時(shí), 適合使用RT-PCR法；組織培養(yǎng)法適合常規(guī)監(jiān)測(cè)；雞胚培養(yǎng)法適合流感疫苗生產(chǎn)。

［1］ 趙慧, 江征, 李娟, 等.流感病毒中和抗體檢測(cè)方法的建立及驗(yàn)證.中國(guó)生物制品當(dāng)雜志, 2014, 27(9):1109-1201, 1206.

［2］ 郭元吉, 程小雯.流行性感冒病毒及其實(shí)驗(yàn)技術(shù).北京：中國(guó)三峽出版社, 1997:87-96.

［3］ 馬輯紅, 何華, 高楓, 等.流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的比較和改進(jìn).中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2006, 16(9):1131-1141.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.30.215

2015-05-13］

124010 遼寧盤(pán)錦檢驗(yàn)檢測(cè)中心（市疾病預(yù)防控制中心）