羊水細胞原代培養和傳代培養方法比較

肖 婕，張萬興，王 歡，余艷婷，袁金蘭

（吉安市婦幼保健院遺傳室，江西吉安343000）

羊水細胞原代培養和傳代培養方法比較

肖 婕，張萬興，王 歡，余艷婷，袁金蘭

（吉安市婦幼保健院遺傳室，江西吉安343000）

羊水細胞培養及染色體核型分析是產前確診染色體疾病診斷的金標準，為妊娠中晚期胎兒臨床診斷提供可靠的科學依據。羊膜腔穿刺是損傷性的取樣技術，對孕婦和胎兒有造成損傷、感染、流產的潛在危險，流產發生率約0.5%［1］。羊水細胞培養因技術要求高、難度大、周期長、易污染、分裂相少，一旦培養失敗，孕婦難接受第二次穿刺取樣。因此，提高羊水細胞培養成功率是關鍵。本研究就羊水細胞的原代培養和傳代培養兩種方法比較。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2013年7月－2014年7月我院產前診斷中心對因各種產前診斷指征就診的169名孕婦，孕周16－26不等，行羊膜腔穿刺術取羊水做染色體檢查。

1.2 培養試劑和器材 CO2培養箱，T型培養瓶（CORNING，型號430639），離心機，倒置顯微鏡，購自BioAMF羊水培養基，廣州達暉公司提供40μg／ml的秋水仙堿。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 在B超引導下，經腹穿刺抽取羊水30ml左右，分裝入2支一次性無菌離心管中，盡快送達實驗室接種。

1.3.2 接種 羊水以1 700r／min離心10分鐘。在超凈工作臺內，棄去上清液，保留0.5ml沉淀，加入5ml羊水培養基吹打混勻。將混勻的兩份羊水細胞分別移入兩個T型培養瓶中，靜置于CO2培養箱中，溫度37℃，CO2濃度5%。

1.3.3 細胞原代和傳代培養 細胞培養6－7天后觀察細胞貼壁及生長情況，此時可見瓶底貼壁細胞已形成克隆。取一瓶做原代培養，直接更換新鮮培養液繼續培養，注意觀察細胞生長情況，適時收獲。另一瓶行傳代培養，棄去原培養液加入新鮮培養液后，用刮刀使瓶壁細胞脫離瓶壁，經吹打混勻后，再次置于培養箱中繼續培養，36小時后觀察羊水細胞克隆大小，適時收獲。

1.3.4 細胞收獲 在倒置顯微鏡下觀察羊水克隆大小及數目，適時加入秋水仙堿處理4－5小時后收獲細胞，用檸檬酸鈉與氯化鉀1∶1，低滲12分鐘加入固定液，預固定8分鐘，離心后去上清液，固定30分鐘后離心。重復做二次固定后，原代與傳代培養每份標本分別滴片四張。

1.3.5 烤片和顯帶 置75－80℃烤箱中烤3小時，用胰酶消化4－5分鐘，行Giemsa染色20分鐘。

1.3.6 觀察和計數 每例標本實驗組與對照組均取第2號玻片，由一人閱片一人核對，分別計數核型出現數、可計數數、可分析數。

1.3.7 統計學分析 應用SPSS13.0軟件行t檢驗分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 羊水細胞生長收獲情況 169例羊水中，原代培養成功162例，成功率95.86%，羊水平均收獲時間為7－8天，同一批羊水常常需要分2—3批次收獲；傳代培養成功率為100%，其中＞20＋6孕周孕婦羊水32例均培養成功。培養時間為8天，收獲時間基本一致，一次即可收獲完成。羊水染色體不同孕周培養成功率見表1。

表1 羊水染色體不同孕周培養成功率

2.2 染色體核型分析情況 兩種方法染色體核型都比較好。原代培養法獲得至少20個可計數型的標本為150例，占已收獲標本總量的92.59%；傳代培養法獲得至少30個可計數核型的標本為152例，另獲得至少20個可計數核型標本為17例，完全可符合WS322.2－2010中華人民共和國衛生行業標準規定觀察報告標準數量。具體羊水染色體分裂相出現情況見表2。

表2 羊水染色體分裂相出現結果

3 討論

羊水細胞主要來源于胎兒的皮膚、消化道、呼吸道等處，大部分是衰老和固縮的脫落細胞，這使羊水細胞培養較其他組織如外周血細胞、皮膚細胞的培養更為困難［2］。尤其是孕中晚期隨著孕周的增加羊水細胞雖有增長，但細胞活性低影響培養成功率。通過對比實驗對比，我們發現：（1）用原代培養較羊水傳代培養步驟更簡單，無需進行傳代，減輕培養期間工作量；不傳代避免因操作造成培養污染；不傳代還避免羊水細胞再貼壁的時間從而縮短羊水報告時間。在羊水克隆較多的情況下，培養成功率很高，便于核型分析。但由于同批羊水，生長情況不同，常常要分2－3批收獲。（2）實驗顯示羊水傳代培養成功率為100%，有足夠的染色體核型便于分析工作。當羊水細胞克隆較少時，進行傳代培養明顯提高了培養成功率。對于大孕周胎兒染色體核型分析，此方法有優勢明顯。培養6－7天時，我們可以在倒置顯微鏡下發現貼壁細胞相互堆集在一起，互相影響不利于生長。我們通過換液后讓羊水細胞脫離瓶壁，重新貼壁更利于生長從而獲得更多更好的分裂相。而且由于細胞再次貼壁時間相同，使得細胞成熟時間基本一致，大大減小了收獲的工作量。（3）在傳代培養中存在部分異常染色體嵌合情況，同一份標本原代培養片中沒有發現異常。據吳堅柱的文章報道羊水的嵌合體發生機制中，染色體制片過程中外力作用使染色體發生斷裂重接、丟失或增加［3］。傳代培養是否增加了假嵌合的風險有待近一步研究。

染色體分析水平的正確性和準確性與否，取決于染色體標本的分裂相數，顯帶的帶紋清晰、豐富、分散效果等問題。制備較高質量的染色體標本防污染是培養的關鍵。技術操作中手法的輕巧是防止丟失的一環。選擇合適的低滲液、固定液及時間是染色體分散顯帶較豐富的重點。

［1］邊旭明，鄔玲仟，姜玉新.實用產前診斷學［M］.北京：人民軍醫出版社，2008：187－188.

［2］Turhan NO，Eren U，Seckin NC.Second－trimester genetic amnio－centesis：5－year experience［J］.Arch Gynecol Obstet，2005，271（1）：19.

［3］吳堅柱，林少賓，張志強，等.63例羊水嵌合體的臨床分析［J］.中華醫學遺傳學雜志，2014，31（4）：523.

2014－08－20）

1007－4287（2015）10－1795－02