3種結(jié)核桿菌檢測(cè)方法在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用研究

王志佳，石少敏，李 丹

3種結(jié)核桿菌檢測(cè)方法在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用研究

王志佳1a，石少敏1b＊，李 丹2

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院a放射線(xiàn)科；b呼吸內(nèi)科，吉林長(zhǎng)春130033；2.吉林省人民醫(yī)院感染科）

結(jié)核病（TB）是一類(lèi)由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性肉芽腫性的炎癥，結(jié)核分枝桿菌可感染全身多個(gè)系統(tǒng)，其中最常見(jiàn)的是肺結(jié)核。據(jù)統(tǒng)計(jì)，當(dāng)前全球已有1／3的人口為結(jié)核病患者［1］，每年約800萬(wàn)－1000萬(wàn)名患者最終發(fā)展成活動(dòng)性結(jié)核病患者，每年約200－300萬(wàn)人死于肺結(jié)核［2］。近年來(lái)，由于耐多藥結(jié)核病（MDR－TB）的流行與傳播、HIV患者的感染，以及全球人口流動(dòng)等問(wèn)題的出現(xiàn)，使結(jié)核病疫情日趨嚴(yán)峻，已成為嚴(yán)重的社會(huì)及公共衛(wèi)生問(wèn)題，TB的預(yù)防和控制顯得尤為重要。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2013年7月至2014年3月收集175例本院（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院）呼吸內(nèi)科就診的疑似活動(dòng)性結(jié)核病人，收集病例完成后對(duì)所有病例進(jìn)行初步的評(píng)估，依據(jù)評(píng)估可以分為二組：活動(dòng)性結(jié)核病患者組、非活動(dòng)性結(jié)核病患者組（臨床的表現(xiàn)可以排除結(jié)核）。活動(dòng)性結(jié)核病病人組又進(jìn)一步分為確診組和臨床診斷組，如果實(shí)驗(yàn)室結(jié)核桿菌培養(yǎng)為陽(yáng)性的或者有明確的病理學(xué)診斷依據(jù)的歸入確診組；臨床表現(xiàn)疑似結(jié)核病患者，通過(guò)抗結(jié)核治療有一定的效果的患者歸位臨床診斷組。

1.2 研究方法

標(biāo)本為研究對(duì)象的痰液、胸腔積液或支氣管鏡肺泡灌洗液。

（1）結(jié)核桿菌檢測(cè)試劑盒（膠體金法）試驗(yàn) 通過(guò)定性檢測(cè)結(jié)核菌的分泌性蛋白質(zhì)，當(dāng)有兩條線(xiàn)同時(shí)出現(xiàn)時(shí)可判斷為陽(yáng)性，只有一條對(duì)照線(xiàn)出現(xiàn)時(shí)則判斷為陰性，其反應(yīng)時(shí)間15分鐘，即可判讀結(jié)果。

（2）TST實(shí)驗(yàn) 使用孟都氏法在檢測(cè)者左前臂的內(nèi)側(cè)皮下注射PPD（0.lml同時(shí)含BCG－PPD 5IU），測(cè)試者局部形成了明顯的皮丘。注射后48－72小時(shí)后測(cè)量在皮膚上形成的硬結(jié)的直徑大小，橫徑和縱徑平均值為硬結(jié)平均直徑（d）d＜5mm定義為陰性病例（－）；d介于5mm到9mm之間定義為弱陽(yáng)性病例（＋）；d介于10mm到19mm之間定義為陽(yáng)性病例（＋＋）；d＞20mm出現(xiàn)破漬、水泡、雙圈強(qiáng)陽(yáng)性定義為強(qiáng)陽(yáng)性病例（＋＋＋）

（3）結(jié)核桿菌DNA PCR檢測(cè) 取測(cè)試者痰液標(biāo)本，5%氫氧化鈉處理兩小時(shí)后置于EP管中離心10分鐘（13000轉(zhuǎn)）后去除離心后的上清，于沉淀物中加入生理鹽水，繼續(xù)離心10分鐘（同轉(zhuǎn)速）。去除離心后的上清，于沉淀中加入TB溶液（30μl），混勻后水浴，首先100℃水浴30分鐘，然后37℃水浴10分鐘，繼續(xù)離心10分鐘（同轉(zhuǎn)速），取離心后上清加入反應(yīng)液中，進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理釆用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析，P≤0.05定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

最終診斷為結(jié)核病46例（26.2%），男女比例3∶1，中位年齡40.2歲。確診組46例中，病理確診1例；結(jié)核桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性41例，余4例診斷為臨床診斷結(jié)核病，為試驗(yàn)性抗結(jié)核治療有效，且均為結(jié)核性胸膜炎；非活動(dòng)性結(jié)核病的患者共110例，男女比例為3∶1，中位年齡46歲，其中肺部感染55例、間質(zhì)性肺病11例、膿胸2例、消化系統(tǒng)感染3例、血液系統(tǒng)疾病3例、惡性腫瘤15例、風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病11例、心功能不全6例、AIDS 4例。

2.1 比較膠體金法、PCR、TST三種不同的方法診斷活動(dòng)性結(jié)核患者敏感度

在最終診斷為結(jié)核病的46例患者中，34例膠體金法檢測(cè)陽(yáng)性，12例陰性，本研究將膠體金法檢測(cè)結(jié)果為（＋）、（＋／－）均統(tǒng)一定性為陽(yáng)性，該方法對(duì)于診斷活動(dòng)性結(jié)核病的敏感度為73.9%。本研究將結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)TST應(yīng)用檢測(cè)患者的皮膚硬結(jié)直徑大小，如果直徑大于10mm均定義為陽(yáng)性，其中31例患者利用TST法檢測(cè)呈現(xiàn)陽(yáng)性，15例被檢測(cè)為陰性，TST法檢測(cè)對(duì)于診斷活動(dòng)性結(jié)核病的敏感度為67.4%。PCR檢測(cè)的46例患者中，21例被定義為陽(yáng)性，25例被定義為陰性，此方法的診斷敏感度為45.7%。膠體金法與TST敏感度比較無(wú)明顯差異（P＞0.05），膠體金法與PCR敏感度比較有明顯差異（P＜0.01）（見(jiàn)表1）。

46例活動(dòng)性結(jié)核病患者，其中16例患者膠體金法測(cè)陽(yáng)性，14例TST檢測(cè)陽(yáng)性，9例PCR檢測(cè)陽(yáng)性，三種檢測(cè)結(jié)核性胸膜炎的敏感度分別為72.7%、63.6%、40.9%。膠體金法與TST敏感度比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）。膠體金法與PCR敏感度比較有明顯差異（P＜0.05）。

2.2 比較膠體金法、TST、PCR在診斷活動(dòng)性結(jié)核病中的特異度

通過(guò)臨床特征和檢測(cè)排除活動(dòng)性肺結(jié)核的110例患者中，利用膠體金法檢測(cè)結(jié)果顯示有89例結(jié)果為陰性，檢測(cè)的特異度高達(dá)80.9%，52例患者TST檢測(cè)為陰性，其特異度為47.3%，95例患者行PCR檢測(cè)陰性，其特異度為86.4%，膠體金法與TST特異度比較有顯著差異（P＜0.001），前者明顯大于后者；膠體金法與PCR特異度比較無(wú)差異（P＞0.05），二者特異度均較高（見(jiàn)表1）。

110例非活動(dòng)性結(jié)核病患者28例行抗原膠體金法檢測(cè)23例陰性，行TST檢測(cè)13例陰性，行PCR檢測(cè)24例陰性，三種檢測(cè)結(jié)核性胸膜炎的特異度分別為82.1%、46.4%、85.7%。膠體金法與TST特異度比較有明顯差異（P＜0.05），膠體金法與PCR特異度比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

2.3 比較膠體金法、TST、PCR檢測(cè)疾病的符合率

膠體金法、TST方法以及PCR方法對(duì)結(jié)核病患者和非結(jié)核病患者進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的符合率分別為78.8%、53.2%、74.4%。膠體金法、TST、PCR鑒別結(jié)核性胸膜炎與非結(jié)核性胸膜炎的符合率分別為78.0%、54.0%、66.0%。膠體金法與TST比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（P＜0.01），膠體金法與PCR比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（見(jiàn)表1）。

表1 三種檢測(cè)方法敏感度、特異度、符合率的比較

3 討論

目前在我國(guó)，僅活動(dòng)性肺結(jié)核病人約450萬(wàn)，且正逐漸增多。近年來(lái)由于各種原因，使得耐藥結(jié)核病人，尤其是MDR－TB病人不斷增加，而臨床上用于MDR－TB的有效抗癆藥物療效有限，使國(guó)民生活質(zhì)量受到嚴(yán)重影響，結(jié)核病亦受到全球的重視。

1999年，研究者利用基因芯片技術(shù)對(duì)H37Rv（結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)株）和BCG基因組進(jìn)行了檢測(cè)比較，發(fā)現(xiàn)了在BCG中缺失的而僅存在于結(jié)核桿菌中的129個(gè)開(kāi)放讀碼框，這些開(kāi)放讀碼框可以劃分為16個(gè)區(qū)域（RD1－RD16），統(tǒng)稱(chēng)為RD區(qū)片段［3］。RD區(qū)編碼的蛋白包括ESAT－6、CFP－10、MPT64、38 kDa、30kDa、Rv3871、Rv3872、Rv3873等，其中ESAT－6、CFP－10是MTB生長(zhǎng)早期分泌的特異性蛋白［4］，MTP64是一種特異性的蛋白質(zhì)［5］，其屬于MTB的一種代謝產(chǎn)物，檢測(cè)MTP64蛋白質(zhì)的水平可以反映MTB總體的生長(zhǎng)情況，近年來(lái)應(yīng)用重組技術(shù)及雜交技術(shù)可制備一些單克隆抗體，像ESAT－6、CFP－10、MPT64，這些單克隆抗體可以被應(yīng)用于MTB的病原的科研中同時(shí)對(duì)結(jié)核病的診斷也有一定的意義［6］。結(jié)核菌檢測(cè)試劑盒（膠體金法）是一種采用上述單克隆抗體作為膠體金標(biāo)記抗體來(lái)檢測(cè)結(jié)核菌分泌的特異性抗原的檢測(cè)工具，此方法可快速簡(jiǎn)便地檢測(cè)各種液體標(biāo)本中的特異性抗原。提高檢測(cè)的特異性和靈敏度可以通過(guò)采用多種抗原聯(lián)合檢測(cè)的手段。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，膠體金法與TST檢出結(jié)核菌的能力相似而高于PCR法。在結(jié)核性胸膜炎中亦存在同樣的結(jié)果。本研究中46例活動(dòng)性結(jié)核病患者出現(xiàn)了12例陰性，其中3例口服莫西沙星片，5例靜脈注射莫西沙星，Johnson JL［7］的實(shí)驗(yàn)認(rèn)為莫西沙星（MXFX）可于感染初期有效殺菌作用，殺菌作用略低于抗結(jié)核藥物異煙肼（INH），MXFX能很好的滲入結(jié)核病變中，能快速殺滅空洞性肺結(jié)核病人痰中部分結(jié)核桿菌，這可能是該12例患者檢測(cè)陰性的原因。另有4例患者留取的血性或膿性痰標(biāo)本培養(yǎng)陽(yáng)性而膠體金法檢測(cè)為陰性，可能是因?yàn)樵摌?biāo)本所含的其他成分對(duì)結(jié)核菌分泌蛋白的萃取和釋放產(chǎn)生干擾，無(wú)法得出可靠結(jié)果，或者痰標(biāo)本存在的不均一性致使取樣差異引起。

本研究中TST特異度與Pai M［8］等的研究中所得結(jié)果相符，在非活動(dòng)性結(jié)核病組中，膠體金法與TST特異度比較P＜0.05，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；膠體金法與PCR特異度比較P＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在非結(jié)核性胸膜炎的胸水中膠體金法與TST特異度比較有顯著差異，說(shuō)明膠體金法在排除非活動(dòng)性結(jié)核病的能力明顯優(yōu)于TST；膠體金法與PCR特異度比較無(wú)明顯差異，提示膠體金法與PCR在排除非活動(dòng)性結(jié)核性疾病的能力相似，且兩種方法在兩組中特異度均較高。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PCR技術(shù)雖然具有較高敏感度及特異度，但仍不可避免出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)，因此PCR技術(shù)還存在穩(wěn)定性不高的因素，這些可能有多方面的因素引起，例如操作的失誤，標(biāo)本本身的因素等［9］。

似然比不受患病率的影響，并且檢測(cè)的穩(wěn)定性很高，可以通過(guò)其判斷實(shí)驗(yàn)診斷結(jié)果顯示出的陽(yáng)陰性是患者患病的大致概率。本研究發(fā)現(xiàn)，在診斷活動(dòng)性結(jié)核病與非活動(dòng)性結(jié)核病中膠體金法的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值明顯高于其他兩種檢測(cè)方法，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，陰性預(yù)測(cè)值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本研究中，膠體金檢測(cè)的PLR為3.87，為三種方法中最高的，NLR為0.32為三種方法中最低的，在結(jié)核性胸膜炎的檢出中亦得到了同樣的趨勢(shì)。

綜上所述，膠體金法具有結(jié)果可靠，操作簡(jiǎn)單、快速，不需進(jìn)行鏡下觀察；適用于一般人群普查快速檢測(cè)。膠體金法檢測(cè)活動(dòng)性結(jié)核病的敏感度較高，且檢測(cè)能力較TST強(qiáng)，但是也存在著預(yù)測(cè)值不是很高的不利因素，因此其對(duì)結(jié)核病的診斷還需要結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)。

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石少敏（1981－），主治醫(yī)師，講師，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病研究。

2014－10－15）

1007－4287（2015）10－1788－03

＊通訊作者