探討變色酸2R－亮綠在腎活檢組織染色中的應用

姚 倫，劉樹軍，高 丹，婁 巖，韓 梅＊

（1.吉林省人民醫院凱旋院區綜合內科，吉林長春130052；2.吉林大學第二醫院）

探討變色酸2R－亮綠在腎活檢組織染色中的應用

姚 倫1，劉樹軍2，高 丹2，婁 巖2，韓 梅2＊

（1.吉林省人民醫院凱旋院區綜合內科，吉林長春130052；2.吉林大學第二醫院）

目前腎活檢病理特殊染色是確診腎臟疾病病理類型的主要手段，Masson三色染色法是腎活檢病理特殊染色主要方法之一，主要反映腎小球內免疫復合物沉積及膠原纖維增生等情況，有效反映腎小球內免疫復合物沉積的形態和特征，對腎臟疾病病理診斷起到決定性的作用［1］。在臨床實踐中發現變色酸2R－亮綠法不僅能達到傳統Masson三色染色法的效果，同時也縮短了染色時間，簡化了染色步驟。本文將變色酸2R－亮綠法所示腎小球內免疫復合物沉積的形態和部位與免疫熒光和電鏡（TEM）比較，以驗證變色酸2R－亮綠法在腎活檢組織染色中應用的可行性和可重復性，以評價其臨床推廣意義。

1 材料與方法

1.1 材料 選取吉林大學第二醫院腎病內科2012年1月至2014年12月，腎穿刺活檢組織標本842例，每例標本分成光鏡、免疫熒光、透射電鏡（TEM）三部分。光鏡標本制作成2μm病理切片，行變色酸2R－亮綠染色；免疫熒光標本制作成3μm免疫熒光切片，行IgG、IgA、IgM、C1q、C3、C4、Fib、HB－sAg、HBcAg、HBeAg染色；TEM標本送于北京大學第一院電鏡室，行醋酸雙氧鈾－檸檬酸鉛染色和TEM檢查。染色結果均由經驗豐富的病理醫師進行評價和診斷。

1.2 染液配制方法 變色酸2R－亮綠染液：磷鎢酸3.2g，冰醋酸4ml，變色液2R2.0g，亮綠1.7g，蒸餾水400ml。

1.3 染色方法 1）石蠟切片常規脫蠟至水；2）媒染劑（10%三氯醋酸、10%重鉻酸鉀等量混合）15min，流水沖洗；3）Harris蘇木精染液3min，流水沖洗；4）1%鹽酸－酒精分化數秒，流水沖洗；5）弱氨水返藍數秒，流水沖洗；6）變色酸2R－亮綠染液數秒；7）0.2%冰醋酸水溶液數秒；8）95%乙醇快速脫水；9）無水乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。

2 結果

2.1 IgA腎病（IgAN）免疫熒光、TEM、光鏡比較

免疫熒光證明IgA（＋＋）、C3（＋）呈團塊狀沉積于腎小球系膜區（圖1，A）。TEM檢查證明腎小球系膜細胞和基質輕度增生，系膜區和副系膜區塊狀電子致密物沉積，基底膜無明顯病變，上皮足突節段融合（圖1，B）。變色酸2R－亮綠染色法顯示腎小球系膜區有紅色物質沉積，即免疫復合物所沉積部位，系膜區及毛細血管襻被染成綠色，其中綠色的系膜區較正常的腎小球寬大，提示系膜基質增生（圖1，C）。變色酸2R－亮綠法所示IgA腎病免疫復合物沉積的形態和部位與免疫熒光和TEM一致。

圖1 IgAN（Lee分級2級） A：免疫熒光IgA（＋＋）呈團塊狀沉積于腎小球系膜區；B：TEM顯示電子致密物系膜區和副系膜區塊狀沉積；C：變色酸2R－亮綠染色法顯示免疫復合物沉積于腎小球系膜區，系膜基質增生

2.2 膜性腎病（MN）免疫熒光、TEM、光鏡比較

免疫熒光證明IgG（＋＋＋）、C3（＋＋）呈顆粒狀沿腎小球毛血管襻呈均勻沉積（圖2，A）。TEM檢查證明腎小球基底膜大部分增厚，節段釘突樣增生，上皮下多數塊狀電子致密物沉積，上皮足突廣泛融合（圖2，B）。變色酸2R－亮綠染色法所示上皮下有紅色物質沉積，即免疫復合物沉積部位，同時綠染基底膜均質增厚（圖2，C）。變色酸2R－亮綠法所示MN免疫復合物沉積的形態和部位與免疫熒光和TEM一致。

圖2 MN（Ⅱ期） A：免疫熒光IgG（＋＋＋）呈顆粒狀沿腎小球毛血管襻呈均勻沉積；B：TEM腎小球基底膜節段釘突樣增生，上皮下多數塊狀電子致密物沉積；C：變色酸2R－亮綠染色法顯示免疫復合沉積于腎小球上皮下，基底膜均勻增厚

2.3 狼瘡性腎炎（LN）免疫熒光、TEM、光鏡比較

免疫熒光證明IgG（＋＋）、IgA（＋＋）、IgM（＋）、C1q（＋＋）、C3（＋＋）、C4（＋＋）及Fib（＋）在腎小球毛細血管襻呈顆粒狀沉積（圖3，A）。TEM檢查證明腎小球內節段性內皮下、上皮下少量電子致密物沉積，上皮足突廣泛融合（圖3，B）。變色酸2R－亮綠法所示LN內皮下有及上皮下紅色免疫復合物沉積，部分呈“白金耳”樣損害（圖3，C）。變色酸2R－亮綠法所示LN免疫復合物沉積的形態和部位與免疫熒光及TEM結果一致。

2.4 乙肝相關性腎炎（HBVN）免疫熒光、TEM、光鏡比較

免疫熒光證明IgG（＋＋）、IgA（＋＋）、C1q（＋＋）、C3（＋＋）、HBsAg（＋＋）、HBcAg（＋＋）呈顆粒狀均勻沉積于腎小球毛細血管襻，少許呈團塊狀在系膜區沉積（圖4，A）。TEM檢查證明腎小球上皮下、基底膜內、節段性系膜區及副系膜區塊狀電子致密物沉積，基底膜大部分不規則增厚，上皮足突廣泛融合（圖4，B）。變色酸2R－亮綠法所示HBVN內皮下有彌漫性的紅色物質沉積，系膜區有少許紅色物質沉積，即免疫復合物沉積的部位，綠染腎小球系膜基質和基底膜提示系膜基質節段性輕度增生及基底膜增厚（圖4，C）。變色酸2R－亮綠法所示HBVN免疫復合物沉積的形態和部位與免疫熒光及TEM一致。

圖3 LN（IV－G（A）） A：免疫熒光IgG（＋＋）呈顆粒狀沿腎小球毛細血管襻沉積；B：TEM腎小球內節段性內皮下、上皮下少量電子致密物沉積，上皮足突廣泛融合；C：變色酸2R－亮綠法顯示毛細血管襻內皮下有及上皮下免疫復合物沉積，部分呈“白金耳”樣損害。

圖4 HBVN A：免疫熒光HBcAg（＋＋）呈顆粒狀均勻沉積于腎小球毛細血管襻，少許呈團塊狀在系膜區沉積；B：TEM腎小球上皮下、基底膜內、節段性系膜區及副系膜區塊狀電子致密物沉積，上皮足突廣泛融合；C：變色酸2R－亮綠法顯示腎小球內皮下及系膜區有均有免疫復合物沉積，系膜基質輕度增生、基底膜增厚

2.5 膜增生性腎小球腎炎（MPGN）免疫熒光、TEM、光鏡比較

免疫熒光證明IgG（＋＋）、C3（＋＋）、C1q（＋＋＋）、IgM（＋＋）呈顆粒狀沿腎小球毛血管襻呈均勻沉積（圖5，A）。TEM檢查證明腎小球上皮細胞腫脹、足突消失，內皮、系膜區及節段電子致密物沉積（圖5，B）。變色酸2R－亮綠染色法所示上皮下、內皮下及系膜區少許有紅色免疫復合物沉積，同時綠染基底膜均質增厚、基質增多（圖5，C）。變色酸2R－亮綠法所示MPGN免疫復合物沉積的形態和部位與免疫熒光及TEM一致。

圖5 MPGN C3（＋＋） A：免疫熒光IgG（＋＋）呈顆粒狀沿腎小球毛細血管襻沉積；B：TEM證明腎小球上皮細胞腫脹、足突消失，內皮、系膜區及節段電子致密物沉積；C：變色酸2R－亮綠法顯示上皮下、內皮下及系膜區有少許免疫復合物沉積，同時綠染基底膜均質增厚、基質增多

2.6 非免疫介導的腎小球疾病免疫熒光、TEM、光鏡比較

微小病變型腎病（MCN）免疫熒光證明免疫熒光均為陰性，即腎小球系膜區和毛細血管襻均無免疫復合物沉積（圖6，A）。TEM檢查證明腎小球各部位均無電子致密物沉積（圖6，A）。變色酸2R－亮綠染色法則均顯示無免疫復合物沉積（圖6，C）。在非免疫復合沉積引起的腎小球疾病的診斷中，變色酸2R－亮綠染法能夠正確的“還原”腎小球病變，無假陽性情況，進而提高臨床診斷的準確率。

圖6 MCN A：免疫熒光均為陰性；B：TEM腎小球各部位均無電子致密物沉積；C：變色酸2R－亮綠法顯示無免疫復合物沉積

3 討論

腎組織病理檢查是腎臟疾病診斷，指導治療，判斷預后及腎臟病研究中不可缺少的手段［2］。腎組織病理切片通過特殊染色可顯示標本中沉積的特殊物質，如免疫復合物和淀粉樣變性等，目前顯示腎臟疾病中免疫復合沉積的形態和部位的主要方法是傳統Masson三色染色法，但病理組織染色與陰離子染料分子的大小和組織的滲透性有關。染料的分子大小，主要依靠分子量來體現，小分子量易穿透結構致密滲透性低的組織，而大分子只能進入結構疏松滲透性高的組織［3］，而傳統Masson三色染色法中的麗春紅和酸性品紅的分子量為480.42和585.53，而變色酸2R的分子量為468.36［4］，故變色酸2R較前兩者更容易穿透結構致密的肌纖維，著色也較為鮮紅；傳統Masson三色染色法中苯胺藍分子質量為737.72，而亮綠分子質量分為792.72［3］，故亮綠分子較容易與腎臟疏松的膠原纖維結合，使腎小球基膜、腎小球基底膜、系膜基質及腎間質呈綠色，并且染色對比度優于苯胺藍。

因此將變色酸2R－亮綠染色法應用于腎臟病理的染色，變色酸2R和亮綠分別代替傳統Masson三色染色法中的麗春紅、酸性品紅和苯胺藍，經大量臨床實踐證明變色酸2R－亮綠染色法染色結果鮮艷，對比度明顯，步驟簡單，節省實踐，總體來講優于傳統Masson三色染色法。

變色酸2R－亮綠染色法染色結果顯示免疫復合物為紅色、細胞核為淡紅色、膠原纖維為綠色、肌纖維為紅色。經過臨床實踐證明變色酸2R－亮綠染色法較準確反應腎小球疾病免疫復合物沉積的部位和形態，并且與TEM和免疫熒光一致，較大程度提高臨床診斷率，為臨床治療提供有力依據。但經變色酸2R－亮綠染色法處理的切片，經長時間存放易褪色，如何避免變色酸2R－亮綠染色切片褪色，對此需要再做進一步研究。

［1］劉 暢，楊 琪，何志軍.腎穿刺病理制片中特殊染色的問題及對策［J］.診斷病理學雜志，2014，21（5）.313.

［2］王玉芳，徐曉艷，武 彥.常用特殊染色在病理診斷中的應用［J］.實用醫技雜志，2013，20（12）.1357.

［3］李繼承.組織學與胚胎學實驗技術［M］.北京：人民衛生出版社，2010：22－26.

［4］李健東.變色酸2R－亮綠染色法在面神經髓鞘染色中的應用［J］.中國耳鼻喉頭頸外科，2004，11（4）：259.

姚倫（1962－），男，學士學位，主任醫師，主要從事腎臟疾病及血液凈化研究。

2015－01－12）

1007－4287（2015）10－1777－03

＊通訊作者