慢性丙型肝炎患者外周血DNT細胞與HCV－RNA病毒載量關系的研究

馬寅芙，李首慶，劉 磊，孫牧男，譚 巖

（吉林省人民醫院，吉林長春130021）

慢性丙型肝炎患者外周血DNT細胞與HCV－RNA病毒載量關系的研究

馬寅芙，李首慶，劉 磊，孫牧男，譚 巖＊

（吉林省人民醫院，吉林長春130021）

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染機體后所引起的傳染性疾病。大多數的丙型肝炎患者感染后轉為慢性，病毒在體內持續存在，慢性丙型肝炎是引起肝硬化和肝癌的重要原因之一。CD3＋CD4－CD8－T細胞（雙陰性T細胞，DNT）是一種新發現的調節性T細胞亞群，研究發現其在移植排斥、自身免疫性疾病、腫瘤免疫、感染性疾病、過敏性疾病以及移植物抗宿主病等疾病中發揮重要作用［1］，成為近年來免疫學研究的熱點之一。本文利用流式細胞術檢測慢性丙型肝炎患者外周血中CD3，CD4，CD8及DNT細胞的表達，PCR方法檢測HCV－RNA病毒載量，研究慢性丙型肝炎患者外周血中DNT細胞的表達與HCV－RNA病毒載量的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取我院2014年8月至2014年12月門診及住院慢性丙型肝炎患者78例，男性33例，女性45例，年齡18－70歲。病例診斷標準符合2004年中華醫學會傳染病與寄生蟲學分會、肝病學分會制定的《丙型肝炎防治指南》［2］。排除甲、乙型等肝炎其他病毒性疾病、自身免疫性肝病、藥物及酒精性肝炎等。健康對照組25例，男12例，女13例，年齡28－66歲，為我院體檢中心體檢結果正常的健康人群。

1.2 標本采集和處理 患者空腹采集靜脈血3ml入生化管，離心取血清進行PCR檢測；1ml入EDTA抗凝管用于流式檢測。

1.3 試劑和儀器 流式細胞儀美國Beckman Coulter Epics XL；熒光定量PCR儀美國ABI 7500。OptiLyse C溶血素購自美國貝克曼庫爾特公司；熒光抗體FITC－CD4／PE－CD8／PE－CY5－CD3購自美國BD；HCV－RNA試劑盒購自上海科華有限公司。

1.4 熒光定量PCR檢測HCV－RNA定量 參考上海科華《丙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒（PCR－熒光探針法）》說明書操作。將檢測結果分為兩組：HCV－RNA＜1＋E003IU／ml，HCV－RNA≥1＋E003IU／ml。

1.5 流式細胞術檢測T細胞亞群及DNT表達量管中加入100μl全血，加FITC－CD4／PE－CD8／PECY5－CD3抗體20μl，混勻室溫避光孵育15分鐘；加入1ml溶血素，混勻避光10分鐘；加入1ml生理鹽水，混勻1 500r／min離心5分鐘；棄上清，加入500μl生理鹽水混勻上機。

1.6 統計學處理 采用SPSS17統計軟件進行數據分析。數據以均數±標準差（x—±s）表示，樣本均數間差異比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCV－RNA病毒含量不同的慢性丙型肝炎患者T細胞亞群表達

慢性丙型肝炎患者無論病毒含量高低CD4＋T淋巴細胞比例及CD4＋／CD8＋比值均低于健康對照組差異有統計學意義（P＜0.05）；隨著病毒含量的升高，CD4＋／CD8＋比值也在持續降低（P＜0.05）（如表1）。

2.2 HCV－RNA病毒含量不同的慢性丙型肝炎患者DNT細胞表達

慢性丙型肝炎患者無論病毒含量的高低其外周血DNT細胞的表達量均高于健康對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。隨著丙肝病毒含量的升高，HCV－RNA≥1＋E003IU／ml的患者外周血中DNT細胞的表達量高于HCV－RNA＜1＋E003 IU／ml患者的表達量，差異有統計學意義（P＜0.05）（如表2）。

表1 HCV－RNA病毒含量不同的慢性丙型肝炎患者T細胞亞群表達

表2 HCV－RNA病毒含量不同的慢性丙型肝炎患者DNT細胞表達

3 討論

丙型肝炎呈世界性分布，約80%的丙型肝炎患者為慢性化發展，約30%的患者發展為肝硬化、肝癌［3］。HCV－RNA是病毒復制的指標，臨床通過HCV－RNA病毒含量的變化來判斷病情，并在治療藥物的選擇及判斷療效上也具有重要意義［4］。目前HCV的致病機制正在研究中，HCV感染后，體內T淋巴細胞缺失及功能紊亂，導致病毒持續感染，使丙型肝炎慢性化。有研究認為［5］，機體對HCV免疫應答低下是導致HCV感染慢性化的主要原因之一。本文研究結果顯示慢性丙型肝炎患者CD4＋T細胞及CD4＋／CD8＋比值低于健康對照組，T淋巴細胞亞群比例異常，導致機體免疫功能紊亂，免疫處于抑制狀態，清除病毒能力下降，從而導致HCV病毒持續感染。

DNT細胞最早發現于成年小鼠的脾臟及人的外周血中，它的含量很低，僅占小鼠和人的外周血淋巴細胞的1%－3%［6，7］。對于DNT細胞的來源和成熟途徑尚不完全清楚。有研究發現DNT可能來源于胸腺pre－TCR DN細胞（DN3）［8］、CD8＋T細胞［9，10］、CD4＋T［11］、胸腺外器官［12，13］等。DNT細胞是一種特殊的調節T細胞，其在體內的免疫調節機制縱說紛紜。DNT細胞能下調高度活化的效應CD4＋T細胞和CD8＋T細胞的擴增和細胞因子的產生［14］，抑制B細胞、NK細胞的活化［15，16］。

病毒特異性CD8＋T淋巴細胞應答低下會導致循環病毒量增加，使病毒難以從機體內被清除，而導致肝炎的慢性化［17］。孫穎［18］等研究發現DNT細胞能夠通過Fss／Fasl途徑殺傷病毒特異性CD8＋T細胞。Zhang［19］等研究發現DNT細胞可殺傷B細胞、CD4＋T細胞和CD8＋T細胞。因此在慢性丙型肝炎患者體內，增高的DNT細胞抑制了CD4＋T細胞及特異性抗病毒CD8＋T細胞功能，機體清除HCV病毒能力下降，使病毒長期存在造成慢性感染。本文研究結果慢性丙型肝炎患者CD4＋T細胞比例下降，而CD8＋T細胞并未降低，可能是非抗病毒CD8＋T細胞增加，而特異性抗病毒CD8＋T細胞減少。

本文研究結果顯示慢性丙肝患者T細胞DNT細胞表達明顯高于健康對照組，并且隨著HCVRNA載量的增加，慢性丙型肝炎患者外周血中DNT細胞表達與HCV－RNA病毒載量呈正相關。DNT細胞高表達使機體免疫應答能力減弱，使機體抗病毒能力降低，丙型肝炎病毒在體內持續復制呈現慢性發展。DNT細胞和T淋巴細胞亞群檢測對慢性丙型肝炎患者免疫功能狀態判斷、病情評估、治療效果中具有重要意義。

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2015－03－09）

1007－4287（2015）10－1754－03

中青年科技創新領軍人才及團隊項目，吉林省腫瘤生物治療創新團隊（20140519018JH）；吉林省科技廳青年科研基金項目（20140520037JH）

＊通訊作者