原肌球蛋白3在大腸癌中的表達和意義

印 璞，李玲霞，高 申＊，宋麗娜，李洪軍，何成彥

（1.吉林省臨床檢驗中心，吉林長春130021；2.吉林大學中日聯誼醫院，吉林長春130033）

原肌球蛋白3在大腸癌中的表達和意義

印 璞1，李玲霞2，高 申2＊，宋麗娜2，李洪軍2，何成彥2

（1.吉林省臨床檢驗中心，吉林長春130021；2.吉林大學中日聯誼醫院，吉林長春130033）

結直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是我國腫瘤發病率上升最快的腫瘤之一。全球每年結直腸癌新發病病例數可達94萬，近50萬人因結直腸癌死亡。結直腸癌患者無淋巴結轉移的，術后五年生存率可達90%［1］，而發生淋巴結轉移的，術后五年生存率僅為65%［2，3］。蛋白質組學技術在對實體腫瘤的分子標志物檢測中顯示出了特有的高靈敏度、特異度［4］。本研究以結腸腺癌組織、癌旁組織為研究對象，進行雙向電泳和質譜分析，篩選結腸腺癌相關特異蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 實驗所需大腸癌組織標本取自吉林大學中日聯誼醫院就診并手術治療的大腸癌患者。標本離體后立即取材，放入液氮冷凍，－80℃保存。經病理學檢查證實，所取大腸癌組織類型是Dukes C期腺癌。

1.1.2 試劑 固相pH梯度干膠條（pH3－10，17 cm；pH5－8，17cm）、礦物油、碘代乙酰胺（IAM）購自Bio－Rad公司（Hercules，CA，USA）、載體兩性電解質。尿素、硫脲、精胺、三羥甲基氨基甲烷、CHAPS、丙烯酰胺、TMED、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉（SDS）、溴酚藍、考馬斯亮藍G－250、苯甲基磺酰氟（PMSF）購于Sigma公司（St1Louis，MO，USA）。瓊脂糖、甲叉雙丙烯酰胺、二硫代蘇糖醇（DTT）、TPCK修飾的測序級胰酶購自Promeg公司。過硫酸銨、碳酸氫氨、硝酸銀、甲醛、乙醇、硫代硫酸鈉、冰乙酸為國產分析純。蛋白質定量試劑盒（RCDC Protein Assay Kit）購于Bio－Rad公司。液相色譜分析儀購自安捷倫公司，LTQXL離子肼質譜儀購自賽默飛世爾公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品總蛋白提取及蛋白濃度測定 分別取50mg癌組織及癌旁組織進行研磨，加入200μl預冷的組織蛋白抽提試劑，冰上放置20min。4℃，12 000g離心1小時，留取上清備用。用考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度，在波長595nm處比色，以標準蛋白含量為橫坐標，以A595nm為縱坐標繪制標準曲線，測定樣品中蛋白質含量，分別分裝并保存在－80℃備用。

1.2.2 樣品蛋白水解多肽混合物的制備 取出凍存總蛋白樣品，平衡至室溫。用3－5倍體積的50 mM NH4HCO3溶解蛋白樣品。加入1M的DTT，調定終濃度至20mM，56℃室溫、避光放置1h。室溫下加入1M的IAM，調定終濃度至50mM，室溫、避光反應半小時。反應體系中按照蛋白：胰酶以50∶1比例加入，放在37℃水浴箱中過夜。酶切產物，－80℃凍干保存。

1.2.3 二維色譜與質譜聯用分離并鑒定多肽混合物 將樣本用緩沖液溶解，取50μg樣本上樣，經反相色譜洗脫的多肽用LTQXL離子肼質譜儀檢測，質譜數據采用Thermo Fisher公司的Bioworks 3.3.1SP1軟件，用SEQUEST進行數據庫檢索，以鑒定出相關多肽和蛋白質。

1.2.4 免疫印跡試驗 采用免疫印跡試驗對選定的目標蛋白－TPM3的表達情況進行進一步的驗證。BCA法定量蛋白，使每個加樣孔中蛋白量相同。TPM3單克隆抗體購于Santa Cruz。內參照為actin。

1.2.5 統計學分析 二維色譜與質譜聯用圖譜依據SEQUEST算法，使用SPSS13.0統計軟件包進行t檢驗。P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 腫瘤組織總蛋白酶解混合物的二維色譜與質譜聯用分析

腫瘤組織總蛋白經酶解后，產物應用二維液相色譜與質譜聯用分析，對獲得的多肽質譜數據采集、整理，得到614個蛋白的鑒定資料。

2.2 癌旁組織總蛋白酶解混合物的二維色譜與質譜聯用分析

癌旁組織總蛋白經酶解后，產物應用二維液相色譜與質譜聯用分析，對獲得的多肽質譜數據采集、整理，得到357個蛋白的鑒定資料。

2.3 腫瘤與癌旁組織差異蛋白質的質譜分析

本實驗中應用譜圖數來評價每個蛋白的豐度。對于蛋白豐度的變化，我們參照以下標準界定：（1）兩個樣品中蛋白譜圖數的差值≥72；（2）兩個樣品中蛋白譜圖數的比值≥1。

將腫瘤組織與癌旁組織的蛋白分析數據依據上述標準進行比對，得到有顯著差異的蛋白共18個。TPM3的質譜圖見圖1。

圖1 TPM3的質譜圖

2.4 TPM3的免疫印跡結果 見圖2。

圖2 TPM3的免疫印跡圖

3 討論

大腸癌是發病率和死亡率都較高的腫瘤，結直腸癌早期的臨床癥狀不明顯，確診時一般已發展到中晚期，喪失了治療的最佳時期，因此對于腫瘤的早期診斷仍是研究的熱點。蛋白質組學技術具有高度自動化、高效率、高通量等優勢，且可以同時檢測組織中全部的蛋白質，利用差異蛋白質組學分析，可以發現發病早期靈敏度高及特異性強的腫瘤標志物，對于腫瘤的早期診斷、早期治療和預后的預測方面都具有非常重要的臨床意義。

本研究對結腸腺癌組織、癌旁組織進行蛋白組學技術研究，選取兩個樣品中蛋白譜圖數的差值≥72，并且兩個樣品中蛋白譜圖數的比值≥1的蛋白進行質譜分析，最終鑒定出18種蛋白。這些表達有差異的蛋白是從結腸癌組織、癌旁組織中比較分析而來，故可認為是結腸癌相關蛋白。

原肌球蛋白（tropomyosin，TM）是肌肉收縮過程中重要的調節蛋白質，廣泛分布于各種真核細胞中，迄今為止尚未發現在原核細胞中存TM。目前，TM中的4個基因已被確認，分別被命名為：TPM1（或α－TM）、TPM2（或β－TM）、TPM3（或γ－TM）、TPM4（或δ－TM）［5］。它們與細胞轉化密切相關。TM家族表達下調可以導致細胞向惡性轉化，恢復其表達水平，可以阻止細胞惡性轉化進程［6］。TPM3基因，即γ－TM基因，編碼含284個氨基酸殘基的成纖維細胞LMWTM30nm即TM5，和含284個氨基酸殘基的慢收縮骨骼肌HMWA－Tm即TM3，迄今在平滑肌中尚未確認有該基因產物。

在試驗中我們發現，TPM3在結腸癌組織中表達明顯下降，再運用蛋白免疫印跡實驗，其結果與雙向電泳一致。證明了在大腸癌組織中TPM3的含量明顯低于癌旁組織，有研究表明，在肝癌、食管癌、慢粒等腫瘤中TPM3的含量與正常組織都有明顯差異［7，8，9］。這說明TPM3在多種腫瘤的發生、發展過程中起到了一定的作用。本研究中發現TPM3在結腸癌組織中表達下降，提示TPM3可能在結腸癌中扮演癌癥抑制因子的重要角色，可能成為結腸癌診斷的分子標記物，但要將其應用于臨床診斷和治療仍有待進一步的研究。

［1］Cancer Facts ＆Figures 2011［R］.American Cancer Society，2011.

［2］Hawk ET，Levin B.Colorectal cancer prevention［J］.J Clin Oncol，2005，23（2）：378.

［3］Ruo L，Gougoutas C，Paty PB，et al.Elective bowel resection for incurable stage IV colorectal cancer：prognostic variables for asymptomatic patients［J］.J Am Coll Surg，2003，196（5）：722.

［4］Posadas EM，Simpkins F，Liotta LA，et a.l Proteom ic analysis for the early detection and rational treatment of cancer－realistic hope［J］.AnnOncol，2005，16（1）：16.

［5］Lees JG，Bach CT，O＇Neill GM.Interior decoration：tropomyosin in actin dynamics and cell migration［J］.Cell Adh Migr，2011，5（2）：181.

［6］Prasad GL，Masuelli L，Raj MH，et al.Suppression of src－induced transformed phenotype by expression of tropomyosin－1［J］.Oncogene，1999，18（11）：2027.

［7］Zhipeng Li，Rong Yang，Jiangning Zhao，et al.Molecular Diagnosis and Targeted Therapy of a Pediatric Chronic Eosinophilic Leukemia Patient Carrying TPM3－PDGFRB Fusion［J］.Pediatr Blood Cancer，2011，56：463.

［8］Maryam Zare，Ferdous Rastgar Jazii，Zahra－Soheila Soheili，et al.Downregulation of Tropomyosin－1in Squamous Cell Carcinoma of Esophagus，the Role of Ras Signaling and methylation［J］.Molecular Carclnogenesis，2012，51：796.

［9］Lam CY，Yip CW，Poon TC，et al.Identification and Characterization of Tropomyosin 3Associated with Granulin－Epithelin Precursor in Human Hepatocellular Carcinoma［J］.PLoS ONE，2012，7（7）：e40324.

2014－10－09）

1007－4287（2015）10－1733－03

吉林省科技廳（2011713，20090461，2010739）；吉林省發改委（2013c026－5）；長春市科技局（2011125）

＊通訊作者